Związane z wiekiem przedziały referencyjne dla poziomów immunoglobulin i podzbiorów limfocytów u indyjskich dzieci Narula G, Khodaiji S, Bableshwar A, Bindra MS

Streszczenie

Tło: U dzieci odporność wrodzona i adaptacyjna różni się w zależności od wieku, stanu choroby i pochodzenia etnicznego, co odzwierciedlają podzbiory limfocytów i poziomy immunoglobulin (Ig) w surowicy. Brak takich danych z subkontynentu indyjskiego spowodował konieczność przeprowadzenia tego badania. Cele: Celem tego badania jest określenie zakresów referencyjnych Ig i podzbiorów limfocytów u dzieci indyjskich od urodzenia do 5 roku życia. Ustawienia i projekt: Noworodki, niemowlęta i dzieci ze szpitala o wyższym poziomie referencyjności zostały wybrane i podzielone na 5 grup od krwi pępowinowej/noworodków do 5 lat. Materiały i metody: Próbki pobrano z krwi pępowinowej i od zdrowych dzieci w wieku do 5 lat. Zbadano pełną morfologię krwi, poziom Ig w surowicy (metodą turbidymetryczną) i podzbiory limfocytów (metodą cytometrii przepływowej) oraz obliczono zakresy referencyjne. Wyniki: Przeanalizowano czterysta trzy próbki; 53 z krwi pępowinowej i 350 od dzieci w wieku od 1 miesiąca do 5 lat. Po urodzeniu stwierdzono wysoki poziom IgG, który obniżył się w ciągu pierwszych 6 miesięcy, a następnie wzrósł. Poziom IgM pozostawał niski w okresie niemowlęcym i osiągnął wartość szczytową w wieku 13-36 miesięcy. Poziom IgA był bardzo niski przy urodzeniu, ale wzrastał wraz z wiekiem. Liczba CD4 była wysoka w krwi pępowinowej do 3 roku życia, a następnie spadła. Liczba CD8 i CD19 utrzymywała się na stałym poziomie do 5 roku życia. Liczba CD56 wzrosła po 2 roku życia. Wnioski: Uzyskane przez nas dane dobrze korelowały z opublikowanym piśmiennictwem, jednak zauważalne różnice dotyczyły wyższych poziomów IgM w grupie 1-3 lat oraz wyższych poziomów naturalnych komórek zabójczych we wszystkich grupach wiekowych w naszym badaniu. Nasze wyniki stanowią największą tego typu bazę danych z naszego kraju.

Słowa kluczowe: Absolute cell count, flow cytometry, lymphocyte profile, lymphocyte subsets, serum immunoglobulins

Jak cytować ten artykuł:
Narula G, Khodaiji S, Bableshwar A, Bindra MS. Interwały referencyjne związane z wiekiem dla poziomów immunoglobulin i podzbiorów limfocytów u indyjskich dzieci. Indian J Pathol Microbiol 2017;60:360-4

Jak cytować ten URL:
Narula G, Khodaiji S, Bableshwar A, Bindra MS. Age-related reference intervals for immunoglobulin levels and lymphocyte subsets in Indian children. Indian J Pathol Microbiol 2017 ;60:360-4. Dostępne z: https://www.ijpmonline.org/text.asp?2017/60/3/360/215390

Wprowadzenie

Wiek dziecięcy jest obarczony predyspozycją do zakażeń. Podstawową obroną gospodarza przed zakażeniem jest odporność wrodzona, która reaguje niezależnie od wcześniejszej ekspozycji na czynnik i obejmuje dopełniacz, interleukiny i komponenty komórkowe. Komponent komórkowy obejmuje fagocyty/makrofagi, neutrofile, komórki dendrytyczne, komórki tuczne, eozynofile, bazofile i komórki NK (natural killer cells). Te identyfikują i eliminują patogeny poprzez kontakt i pochłanianie, ale są niespecyficzne i nie zapewniają długotrwałej odporności.

Odporność nabyta (adaptacyjna) jest wysoce specyficzną odpowiedzią, która obejmuje limfocyty T i B oraz komórki NK. W odpowiedzi tej pośredniczą dwa podstawowe mechanizmy, odporność komórkowa przez limfocyty T i odporność humoralna z wytwarzaniem immunoglobulin (Ig) przez 5 funkcjonalnie odrębnych podtypów komórek B. Synteza rozpoczyna się w okresie płodowym. Synteza rozpoczyna się w życiu płodowym i przebiega w sposób zróżnicowany w zależności od typu Ig, ekspozycji na antygen, rasy i pochodzenia etnicznego. Nieprawidłowości w układzie odpornościowym mogą powodować zwiększoną podatność na infekcje i inne schorzenia, takie jak alergie, autoagresja i nowotwory złośliwe. Oszacowanie poziomu Ig w surowicy oraz bezwzględnej liczby i odsetka podzbiorów limfocytów pomaga we wczesnym rozpoznaniu i leczeniu takich stanów. Jednak w Indiach dostępnych jest bardzo niewiele zakresów referencyjnych dla tych parametrów, specyficznych dla wieku. Te, które są dostępne, dotyczą głównie osób rasy kaukaskiej, a w najlepszym przypadku obejmują mniejszości etniczne z tego regionu. Prawdopodobieństwo istnienia różnic rasowych zostało ustalone w co najmniej jednym dużym badaniu azjatyckim. Niewłaściwe jest ekstrapolowanie tych wyników na dzieci z subkontynentu indyjskiego, które są znacznie bardziej zróżnicowane etnicznie i dorastają w środowiskach i społeczno-ekonomicznych, które znacznie różnią się od ich zachodnich odpowiedników. Niedostatek zakresów referencyjnych u zdrowych dzieci indyjskich doprowadził do przeprowadzenia niniejszego badania, którego celem było określenie przedziałów referencyjnych poziomów Ig i podzbiorów limfocytów krwi obwodowej we krwi pępowinowej i u dzieci od urodzenia do 5 roku życia.

.

Materiały i metody

Populacja badana obejmowała noworodki, które były poddane badaniu. Badana populacja składała się z noworodków urodzonych w szpitalu III stopnia referencyjności (od których pobrano krew pępowinową) oraz niemowląt i dzieci odwiedzających poradnie lub oddziały ambulatoryjne w tym samym ośrodku. Zostały one podzielone na 5 kategorii wiekowych:

1. Krew pępowinowa noworodków urodzonych w terminie
2. Wczesne niemowlęta (1-6 miesięcy)
3. Późne niemowlęta (7-12 miesięcy)
4. Niemowlęta (13-36 miesięcy)
5. Dzieci w wieku przedszkolnym (37-60 miesięcy).

Kryteria włączenia do badania były następujące:

1. Krew pępowinowa pochodząca z prawidłowych, terminowych porodów, bez żadnych komplikacji przedporodowych lub rodzinnego wywiadu w kierunku niedoborów odporności lub nowotworów złośliwych
2. Normalne niemowlęta i małe dzieci uczęszczające do poradni dla niemowląt
3. Dzieci uczęszczające do ambulatorium z powodu dolegliwości niezwiązanych z infekcjami (np, złamania), ale poza tym w widocznym dobrym stanie zdrowia, stwierdzonym na podstawie rutynowego wywiadu i badania
4. Dzieci na wizytach kontrolnych, ponad 2 tygodnie po wyzdrowieniu po rutynowych samoograniczających się infekcjach dziecięcych, takich jak infekcje wirusowe górnych dróg oddechowych lub pojedynczy epizod samoograniczającego się wirusowego zapalenia jelit
5. Pacjenci na wizytach kontrolnych z powodu zaburzeń chirurgicznych, które nie były w żaden sposób związane z infekcjami i całkowicie się zagoiły/wyzdrowiały.

Kryteria wykluczenia były następujące:

1. Każdy pojedynczy epizod ogólnoustrojowego zakażenia układu narządowego w przeszłości, na przykład zapalenie płuc
2. Wszystkie przypadki chorób zakaźnych, takich jak dur brzuszny, malaria, świnka, odra, ospa wietrzna, i zapalenie wątroby
3. Dzieci z infekcjami górnych dróg oddechowych (URTI) – jeśli liczba samoograniczających się infekcji wirusowych przekroczyła 10 w ciągu ostatnich 12 miesięcy lub jeśli miały jakikolwiek powiązany epizod pyogennego zapalenia gardła, ropne zapalenie gardła, ropne zapalenie ucha lub zapalenie zatok
4. Dzieci z zakażeniami przewodu pokarmowego – jeśli liczba samoograniczających się zakażeń wirusowych przekroczyła 1 w ciągu poprzednich 12 miesięcy lub jeśli wystąpił epizod biegunki bakteryjnej, pasożytniczej lub grzybiczej
5. Wszystkie przypadki zakażeń pasożytniczych lub grzybiczych
6. Przypadki z objawami lub zespołami atopowymi
7. Pacjenci z nowotworem złośliwym w wywiadzie.

Od rodziców pobierano świadomą zgodę i szczegółowy wywiad, a także przeprowadzano dokładne badanie dziecka. Próbki krwi pępowinowej pobierano z łożyska na sali porodowej/operacyjnej bezpośrednio po porodzie do 2 jałowych wacików z kwasem etylenodiaminotetraoctowym i 1 jałowego. Próbki krwi żylnej pobierano w warunkach ambulatoryjnych. Pełne morfologie krwi wykonano przy użyciu automatycznego licznika komórek ABX Pentra™ model no-120. Poziom Ig w surowicy oceniano metodą turbidometryczną przy użyciu automatycznego turbidometru Quantiamate™ opartego na kuwecie firmy Tulip Diagnostics Pvt Ltd®. Oznaczenie markerów powierzchni komórek wykonano metodą czterokolorowej, dwulaserowej cytometrii przepływowej przy użyciu aparatu FACSCalibur™ firmy Becton Dickinson Biosciences ®. Probówki TruCount Multitest zostały użyte do oceny podzbiorów limfocytów. Próbki, które nie mogły być analizowane natychmiast, były przechowywane do 24 godzin w temperaturze 18-22°C przed oceną.

Wyniki

Przeanalizowano łącznie 403 próbki, z czego 53 stanowiły próbki krwi pępowinowej, a 350 pochodziło od dzieci w wieku od 1 miesiąca do 5 lat, podzielonych na podzbiory w zależności od wieku. Stosunek mężczyzn do kobiet wynosił 1,1:1.

Tabela 1: Profil demograficzny badanej populacji Click here to view

Poziom immunoglobulin w surowicy
Średni poziom IgG w surowicy był wysoki w krwi pępowinowej (978mg/dL), obniżając się do nadiru 611,2 mg/dL w późnym niemowlęctwie, a następnie wzrastając do poziomu dorosłych w 5 roku życia i .

Tabela 2: Stężenie IgG, IgM w surowicy, i poziomy IgA w mg/dL (n=403) Kliknij tutaj, aby wyświetlić

Rycina 1: Poziomy immunoglobulin w surowicy w różnym wieku Click here to view

Poziomy IgM w surowicy były niskie w krwi pępowinowej (średnia 22.4 mg/dL) i stopniowo wzrastał do 5 roku życia. Jednakże w trzecim roku życia zaobserwowano duży rozrzut z wysokimi wartościami (średnio 289,6 mg/dl) .
Średni poziom IgA był bardzo niski we krwi pępowinowej (średnio 3,35 mg/dl), ale wzrastał liniowo do 5 roku życia i .
Profil limfocytów
Absolutna liczba CD4 była wysoka we krwi pępowinowej i pozostawała na tym samym poziomie do 3 roku życia, a następnie zaczęła spadać. Liczba CD8 była niska we krwi pępowinowej, ale wzrosła w wieku 6 miesięcy, po czym utrzymywała się na stałym poziomie do 5 roku życia. Liczby CD3 były wysokie przy urodzeniu, odzwierciedlając podwyższone liczby CD4 i podążały za wzorem liczb CD4 we wszystkich grupach wiekowych. Komórki NK nie mogły być policzone w krwi pępowinowej z powodu problemów technicznych, ale były niskie przy urodzeniu i zaczęły wzrastać od 2 roku życia. Limfocyty B mierzone przez CD19 były również niskie w okresie niemowlęcym i stopniowo wzrastały wraz z wiekiem.

Tabela 3: Bezwzględna liczba podzbiorów limfocytów w komórkach/cmm w zależności od wieku (n=403, dla CD16/56, n=350) Click here to view

Dyskusja

Odporność wrodzona i adaptacyjna są wymagane do zwalczania infekcji dziecięcych wywołanych przez różne patogeny. Dlatego też zaburzenia pierwotnej lub nabytej funkcji immunologicznej mogą być przyczyną poważnej zachorowalności i śmiertelności. Oszacowanie poziomu Ig w surowicy i podzbiorów limfocytów pomaga w ocenie odpowiedzi immunologicznej, a także potrzebie interwencji. Badania na całym świecie wykazały, że poziomy Ig różnią się nie tylko z wiekiem, ale także w różnych regionach geograficznych.,, Dlatego też podjęto to badanie w celu określenia specyficznych dla wieku zakresów referencyjnych dla tych parametrów u dzieci indyjskich. Wielkość próby była odpowiednia dla analizowanych podgrup. W naszym badaniu uwzględniliśmy 138 (39%) dzieci z rutynowymi infekcjami dziecięcymi, które ustąpiły ponad 2 tygodnie przed pobraniem próbki, zgodnie z naszymi kryteriami włączenia/wyłączenia.
W pierwszym badaniu tego rodzaju dotyczącym poziomu Ig w surowicy, Collins-Williams i wsp. przebadali 200 dzieci przy użyciu techniki Hyland Immunoplate i stwierdzili, że poziom IgG wahał się od 346 mg% w wieku 2-6 miesięcy do 645 mg% w wieku 2-5 lat. Były one niższe niż poziomy 941 mg% i 1487 mg%, odpowiednio, w naszym badaniu. Może to wynikać z większej liczby rutynowych infekcji dziecięcych nawet u zdrowych dzieci w naszej populacji. Poziomy IgA i IgM były jednak porównywalne. Oba badania wykazują wzrost poziomu Ig w surowicy wraz z wiekiem. Jednakże, ze względu na różnice w technice, porównania powinny być dokonywane z ostrożnością, zwłaszcza, że technika immunopłytkowa Hylanda jest obecnie przestarzała. Inne podobne badanie przeprowadzone przez Stoopa i wsp. w 1969 roku na dzieciach i dorosłych wykazało stopniowy wzrost poziomu Ig w surowicy wraz z wiekiem; jednakże zakresy referencyjne różniły się od innych badań z tego okresu, a głównym powodem był brak ustalonego międzynarodowego punktu odniesienia dla oznaczania Ig w tym czasie.,,

W naszym badaniu poziom IgG w surowicy był podwyższony w krwi pępowinowej i we wczesnym niemowlęctwie, wskazując na bierny transfer przezłożyskowy od matki, co jest obszernie udokumentowane. IgG nadaje bierną odporność na powszechne infekcje w niemowlęctwie. W późniejszym okresie niemowlęcym poziom IgG obniżył się i osiągnął nadir w wieku 7-12 miesięcy, po czym stopniowo wzrastały wartości, co jest dobrze udokumentowanym zjawiskiem…, Nasze dane są porównywalne z tymi badaniami, z pewnymi zauważalnymi różnicami.

Tabela 4: Porównanie wartości IgG specyficznych dla wieku (mg/dL) z innymi badaniami Kliknij tutaj, aby wyświetlić

W innym badaniu, Lockitch i wsp. połączyli wszystkie dzieci poniżej 1 roku w jedną grupę, co sprawiło, że różnice w podgrupach były nieporównywalne. Górne zakresy IgG w obu porównywanych badaniach są znacznie niższe w grupie wiekowej 1-5 lat niż nasze, podczas gdy dolne zakresy pozostają bliższe sobie. Może to wynikać z większej liczby ostatnich infekcji, choć o charakterze rutynowym i ponad 2-tygodniowym okresie po wyzdrowieniu, u naszych pacjentów.
Poziomy IgM były niskie w krwi pępowinowej (średnia-22 mg/dl) i wykazywały stopniowy wzrost z najwyższymi poziomami w grupie wiekowej 13-36 lat (średnia-289 mg/dl), podobnie do znanych wzorców. Niski poziom w krwi pępowinowej może odzwierciedlać niezdolność IgM do pokonania bariery łożyskowej. Podwyższony poziom IgM w wieku 13-36 miesięcy odpowiada zwiększonej częstości występowania infekcji w tej grupie wiekowej.
Poziom IgA był również niski w krwi pępowinowej, podobny do poziomu IgM, ale wzrastał bardziej stopniowo i utrzymywał się na stałym poziomie w dzieciństwie po 3 roku życia. Podobny wzór wzrostu został odnotowany przez innych.,
Odpowiednie dla wieku zmiany w poziomach Ig w surowicy w naszym badaniu wraz z ich indywidualnymi różnicami zostały przedstawione na skonsolidowanym wykresie rozrzutu .
Podzestawy limfocytów analizowane za pomocą cytometrii przepływowej wykazały, że poziomy bezwzględnej liczby CD4 były wysokie we krwi pępowinowej, pozostawały na tym samym poziomie do 3 roku życia, a następnie spadały. Dwa duże badania dotyczące tego aspektu wykazały podobny trend.., .

Tabela 5: Porównanie bezwzględnej liczby CD4 w komórkach/cmm z innymi badaniami Click here to view

W naszym badaniu liczba CD4 zmniejszyła się ze średniej 2932 komórek/μL w niemowlęctwie do 1977 komórek/μL w wieku 3-5 lat. Warto zauważyć, że wartości pozostają porównywalne z tymi badaniami pomimo polityki powszechnej immunizacji BCG przy urodzeniu, która była w 100% naszej populacji badanej. Jest ona rutynowo podawana w Indiach i jest znanym stymulantem komórek T.

Bezwzględna liczba komórekCD8 była niska we krwi pępowinowej (średnia 836 komórek/μL), ale wzrosła po urodzeniu (średnia 1544 komórek/μL), po czym pozostała na stałym poziomie do 5 roku życia. Dwa duże badania wykazały podobne tendencje, chociaż jedno z nich wykazało stały spadek liczby CD8 i całkowitej liczby CD3 po 3 latach.,, Bezwzględna liczba CD3 była wysoka po urodzeniu, odzwierciedlając podwyższoną liczbę CD4 i podążała za tym ostatnim wzorcem we wszystkich grupach wiekowych, wzorcem dobrze ugruntowanym w zachodniej literaturze.,, Liczba komórek NK (CD16/56) była niska przy urodzeniu (średnia 15,8 komórek/μL) i stopniowo wzrastała wraz z wiekiem (średnia 103 i 556 komórek/μL odpowiednio w 1-3 i 2-5 roku życia), co jest zgodne ze skąpymi danymi dostępnymi na temat tej linii komórkowej.,,, Tendencja do wyższej liczby komórek NK u naszych dzieci, w porównaniu z dziećmi rasy kaukaskiej, odpowiada wynikom zaobserwowanym w jedynym innym dużym badaniu dzieci azjatyckich. Inne badanie z Indii dotyczące podzbiorów limfocytów T miało 138 dzieci, ale obejmowało grupy wiekowe od 3 do 15 lat, a zatem nie było w pełni porównywalne z naszymi danymi.
Komórki CD19 wykazały szczyt we wczesnym niemowlęctwie i zmniejszyły się następnie pozostając na stałym poziomie do 5 roku życia. Inne badania wykazały podobny wzór do 5 roku życia, a następnie stały spadek do dorosłości., Szczyt we wczesnym niemowlęctwie w całym prawdopodobieństwie odnosi się do wielu szczepień stymulujących komórki B w tym okresie.
Różne tempo spadku w podzbiorach limfocytów prowadzić do rozbieżności w ich procentach i proporcjach z wiekiem, jak zauważono w naszym badaniu. Zostało to podkreślone w dużym badaniu obejmującym osoby od dzieciństwa do dorosłości i jest szczególnie istotne w badaniu zmian w niedoborach odporności, w tym pediatrycznej infekcji HIV.
W związku z wysoką częstością występowania nawracających łagodnych infekcji wirusowych u dzieci w grupie wiekowej 1-5 lat, celowo włączyliśmy dzieci z tymi warunkami, ale które wyzdrowiały 2 tygodnie przed zebraniem próbki, abyśmy mogli dojść do bardziej realistycznego zakresu referencyjnego dla dzieci. Do najczęstszych infekcji należały infekcje układu oddechowego, a następnie infekcje przewodu pokarmowego. Większość zakażeń wystąpiła w grupie wiekowej 13-36 miesięcy.
Wysokie poziomy IgM i IgA u dzieci w wieku 13-36 miesięcy odzwierciedlają odpowiedź immunologiczną spowodowaną ekspozycją na czynniki zakaźne, która jest powszechna w tym wieku w naszym kraju.

Wysokie bezwzględne liczby limfocytów w niemowlęctwie w naszym badaniu są prawdopodobnie spowodowane przez przezłożyskowym przejściem limfocytów T, które przyczyniają się do odporności komórkowej i samorozpoznania regulowanego przez komórki T w życiu płodowym.artości bezwzględne uzyskane w tym badaniu są największym bankiem danych tego rodzaju z Indii i wskazują na tendencje tych parametrów u indyjskich dzieci z różnych grup etnicznych i mogą stanowić użyteczny zakres odniesienia dla subkontynentu.

Wnioski

• Odpowiednie dla wieku prawidłowe poziomy Ig w surowicy krwi pępowinowej.Uzyskano specyficzne dla wieku normalne poziomy Ig w surowicy krwi pępowinowej i zdrowych indyjskich dzieci od urodzenia do 5 roku życia jako standardowe odniesienie. Poziomy immunoglobulin u dzieci indyjskich różniły się od innych populacji, choć tendencje były porównywalne
• Specyficzne dla wieku podzbiory limfocytów dzieci zdrowych uzyskano z krwi pępowinowej do 5 roku życia. Tendencje były porównywalne z innymi populacjami, chociaż wartości bezwzględne i zakres różniły się u dzieci indyjskich
• Badanie to dostarcza największych i najbardziej reprezentatywnych danych tego rodzaju u zdrowych dzieci indyjskich o szerokiej różnorodności etnicznej
• Tzw. zdrowe dzieci powszechnie mają łagodne infekcje URTI, które mogą zmieniać poziom Ig i liczbę limfocytów. Ustanowiliśmy zatem znormalizowane zakresy referencyjne dla dzieci, które są bardziej realistyczne niż ustanowienie przedziałów referencyjnych na całkowicie zdrowych dzieciach.

Wsparcie finansowe i sponsoring
Nie dotyczy.
Konflikt interesów
Nie ma konfliktu interesów.

	Roitt M, Delves PJ, redaktorzy. Innate immunity. In: Immunology. 10th ed. Massachusetts: Blackwell; 2001. s. 1-21.
	Langermans JA, Hazenbos WL, van Furth R. Antimicrobial functions of mononuclear phagocytes. J Immunol Methods 1994;174:185-94.
	Guermonprez P, Valladeau J, Zitvogel L, Théry C, Amigorena S. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annu Rev Immunol 2002;20:621-67.
	Pancer Z, Cooper MD. The evolution of adaptive immunity. Annu Rev Immunol 2006;24:497-518.
	Lee BW, Yap HK, Chew FT, Quah TC, Prabhakaran K, Chan GS, et al. Age- and sex-related changes in lymphocyte subpopulations of healthy Asian subjects: From birth to adulthood. Cytometry 1996;26:8-15.
	Collins-Williams C, Toft B, Generoso L, Moscarello M. Quantitative immunoglobulin levels (IgG, IgA and IgM) in children, determined by the Hyland immunoplate technique. Can Med Assoc J 1967;96:1510-3.
	Stoop JW, Zegers BJ, Sander PC, Ballieux RE. Serum immunoglobulin levels in healthy children and adults. Clin Exp Immunol 1969;4:101-12.
	Stiehm ER, Fudenberg HH. Serum levels of immune globulins in health and disease: A survey. Pediatrics 1966;37:715-27.
	Buckley RH, Dees SC, O’Fallon WM. Immunoglobuliny w surowicy. I. Levels in normal children and in uncomplicated childhood allergy. Pediatrics 1968;41:600-11.
	Nevard CH, Gaunt M, Ockleford CD. The transfer of passive and active immunity. In: Chaouat G, editor. The Immunology of the Fetus. 1st ed. Florida: CRC Press; 1990. s. 193-214.
	Lockitch G, Halstead AC, Quigley G, MacCallum C. Age- and sex-specific pediatric reference intervals: Study design and methods illustrated by measurement of serum proteins with the Behring LN nephelometer. Clin Chem 1988;34:1618-21.
	Brugnara C. Wartości referencyjne w niemowlęctwie i dzieciństwie – Dodatek 64, 67, 68. In: Orkin SH, Fisher DE, Look AT, Lux SE, IV, Ginsburg D, Nathan DG, editors. Nathan and Oski’s Hematology and Oncology of Infancy and Childhood. 8th ed. Philadelphia: Elsevier Saunders; 2015. s.2527-28.
	Kotylo PK, Fineberg NS, Freeman KS, Redmond NL, Charland C. Reference ranges for lymphocyte subsets in pediatric patients. Am J Clin Pathol 1993;100:111-5.
	Denny T, Yogev R, Gelman R, Skuza C, Oleske J, Chadwick E, et al. Lymphocyte subsets in healthy children during the first 5 years of life. JAMA 1992;267:1484-8.
	Comans-Bitter WM, de Groot R, van den Beemd R, Neijens HJ, Hop WC, Groeneveld K, et al. Immunofenotyping of blood lymphocytes in childhood. Reference values for lymphocyte subpopulations. J Pediatr 1997;130:388-93.
	Spits H, Lanier LL, Phillips JH. Development of human T and natural killer cells. Blood 1995;85:2654-70.
	Yokoyama WM. Natural killer cell receptors. Curr Opin Immunol 1995;7:110-20.
	Swaminathan S, Hanna LE, Raja A, Sankaran K, Kumar AN. Age-related changes in blood lymphocyte subsets of South Indian children. Natl Med J India 2003;16:249-52.
	Hicks MJ, Jones JF, Minnich LL, Weigle KA, Thies AC, Layton JM. Age-related changes in T- and B-lymphocyte subpopulations in the peripheral blood. Arch Pathol Lab Med 1983;107:518-23.
	Hulstaert F, Hannet I, Deneys V, Munhyeshuli V, Reichert T, De Bruyere M, et al. Age-related changes in human blood lymphocyte subpopulations. II. Varying kinetics of percentage and absolute count measurements. Clin Immunol Immunopathol 1994;70:152-8.