Rapid Differentiation of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus and Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus from Blood Cultures by Use of a Direct Cefoxitin Disk Diffusion Test

W ciągu ostatnich kilku dekad znacznie wzrosła częstość występowania zakażeń krwi wywołanych przez Staphylococcus aureus w placówkach służby zdrowia i w środowisku (20). W raporcie National Nosocomial Infections Surveillance System za okres od stycznia 1992 r. do czerwca 2001 r. stwierdzono, że ponad 55% izolatów S. aureus było opornych na metycylinę, oksacylinę lub nafcylinę (16). Do czynników ryzyka związanych z bakteriemią metycylinooporną S. aureus (MRSA) należą: pobyt w placówce o przedłużonym trybie życia, wcześniejsza ekspozycja na antybiotyki, cukrzyca insulinozależna, długotrwała hospitalizacja, cewnikowanie dróg moczowych, założenie zgłębnika nosowo-żołądkowego, wcześniejsze zabiegi chirurgiczne oraz choroba podstawowa (13, 18, 19). U osób w podeszłym wieku (≥65 lat) ryzyko zgonu z powodu bakteriemii wywołanej przez MRSA jest znacznie większe niż u osób młodszych (18, 22).

Zakażenie MRSA naraża pacjenta na zwiększone ryzyko dalszych problemów zdrowotnych. Bakteriemia MRSA wiąże się ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia ostrej niewydolności nerek, dłuższym pobytem w szpitalu i na oddziale intensywnej terapii, rozwojem zależności od respiratora i zwiększonymi kosztami leczenia szpitalnego (1, 6, 15). W kilku badaniach wykazano, że pacjenci z zakażeniami krwi wywołanymi przez MRSA są obciążeni znacznie większym ryzykiem śmiertelności niż pacjenci z zakażeniami krwi wywołanymi przez S. aureus wrażliwe na metycylinę (MSSA) (1, 5, 19). Szacuje się, że śmiertelność wśród pacjentów, u których rozwinie się bakteriemia wywołana przez MRSA wynosi od 23% do 54% (1, 8).

Pacjenci z bakteriemią wywołaną przez MRSA są również narażeni na zwiększone ryzyko opóźnienia leczenia (15). Niewłaściwy wybór antybiotyków u pacjentów z bakteriemią S. aureus był również związany z wyższą śmiertelnością szpitalną (10). Niewłaściwe terapie obejmowały β-laktamy w przypadku bakteriemii MRSA i wankomycynę w przypadku bakteriemii MSSA. Początkowy wybór wankomycyny w przypadku bakteriemii MSSA wiązał się z częstszym występowaniem opóźnionego ustąpienia zakażenia, a opóźniona odpowiednia terapia u pacjentów z MRSA jest niezależnym predyktorem śmiertelności (10, 15).

Wybór terapii w zakażeniach krwi stał się krytyczny w związku z narastającą antybiotykoopornością wielu organizmów. Wzrost liczby organizmów Gram-dodatnich opornych na wankomycynę zagraża wielu przyjętym schematom leczenia i uzasadnia empiryczne stosowanie glikopeptydów w zakażeniach krwi (12). Dlatego też, szybsza charakterystyka izolatów S. aureus z posiewów krwi jako opornych na oksacylinę lub wrażliwych na oksacylinę jest ważnym czynnikiem w szybkim i dokładnym leczeniu pacjentów z bakteriemią.

Próbki posiewów krwi pobierano do butelek tlenowych i beztlenowych (butelki BacT/Alert FA i BacT/Alert FN; bioMérieux, Durham, NC) i oznaczano w aparacie BacT/Alert 3D (bioMérieux, Durham, NC). Próbki posiewów krwi, które w barwieniu metodą Grama wykazywały obecność „Gram-dodatnich kokcytów w skupiskach”, nasączano wymazówką z podwielokrotnej części uzyskanej z butelki z krwią, stosując tę samą technikę, którą stosuje się w przygotowaniu testu wrażliwości metodą dyfuzji krążkowej (3). Wymazówka została następnie użyta do naniesienia smug na całą powierzchnię 100-mm tryptycznej sojowej płytki agarowej z krwią (BD BBL, Franklin Lakes, NJ), tak jak w przypadku testu dyfuzyjnego. Następnie na środku płytki umieszczano krążek z cefoksytyną (BBL Sensi-Disc, Franklin Lakes, NJ), a płytki inkubowano przez noc (10 do 24 godzin) w temperaturze 35 do 37°C w powietrzu atmosferycznym. Następnego dnia rano mierzono i zapisywano wielkość strefy cefoksytyny. Zmierzone wyniki wielkości strefy cefoksytyny porównywano z wynikami uzyskanymi w testach potwierdzających. Testy potwierdzające obejmowały badanie wrażliwości wyizolowanych organizmów na oksacylinę zarówno za pomocą karty wrażliwości Vitek 2 GP-63 (bioMéreiux, Durham, NC), jak i standardowego testu dyfuzyjnego z zastosowaniem cefoksytyny (3, 4). Organizmy identyfikowano jako S. aureus za pomocą 4-h testu koagulazy w probówce, wykonywanego bezpośrednio z bulionu do posiewu krwi; identyfikacje zgłaszano tego samego dnia, w którym uzyskano pozytywny wynik posiewu krwi. Jeśli bezpośredni test koagulazowy w probówce był ujemny, badanie koagulazowe na szkiełku mikroskopowym i/lub w probówce wykonywano na wyizolowanych koloniach następnego dnia rano, kiedy odczytywano wielkość stref dla cefoksytyny.

Przebadano łącznie 782 próbki krwi, z których w 276 wyhodowano czystą kulturę S. aureus (od 103 pacjentów). W sumie w 489 próbkach wyhodowano gronkowce koagulazoujemne (CNS), w 12 wyhodowano Micrococcus species, w 4 wyhodowano zarówno S. aureus jak i CNS, a w 1 wyhodowano Micrococcus species i CNS. Spośród 276 czystych kultur S. aureus, 105 (38,1%) miało wielkość strefy bezpośredniej cefoksytyny mierzącą ≤17 mm, 18 (6,5%) miało wielkość strefy mierzącą 18 mm, 8 (2,9%) miało wielkość strefy mierzącą 19 mm, 8 (2,9%) miało wielkość strefy mierzącą 20 mm, a 137 (49,6%) miało wielkość strefy mierzącą ≥21 mm (Rys. 1). Wszystkie próbki, które miały wielkość strefy ≤17 mm przy bezpośrednim teście z krążkiem cefoksytyny, zostały potwierdzone jako oporne na oksacylinę przez obie metody potwierdzające, a wszystkie próbki, które miały wielkość strefy ≥21 mm przy bezpośrednim teście z krążkiem cefoksytyny, zostały potwierdzone jako wrażliwe na oksacylinę przez obie metody potwierdzające. Tak więc, wykrycie MRSA lub MSSA w posiewach krwi można było zgłosić 10 do 24 godzin wcześniej w przypadku 88% posiewów z całkowitą dokładnością.

Trzydzieści cztery próbki o wielkości strefy między 18 a 20 mm zawierały kombinację izolatów MRSA i MSSA. Spośród tych 34 próbek, 29 (85,3%) zostało potwierdzonych jako MRSA, a 5 (14,7%) jako MSSA. Ten zakres wielkości stref został następnie opisany jako „nieokreślony”, ponieważ wyniki oksacyliny dla organizmów mieszczących się w tym zakresie nie mogły być ustalone za pomocą bezpośredniego badania z użyciem krążka cefoksytyny ze 100% dokładnością, lecz musiały czekać na wykonanie badania potwierdzającego. Można nawet rozważyć nazwanie wszystkich organizmów o średnicy strefy między 18 a 20 mm przypuszczalnym MRSA, ponieważ ponad 85% tych próbek zostało uznanych za MRSA podczas badania potwierdzającego. Te zakresy stref (MRSA, ≤20 mm; MSSA, ≥21 mm) sprawiłyby, że dokładność bezpośredniego testu dyskowego z cefoksytyną wynosiłaby >96%.

Czas inkubacji oceniono dla wszystkich badanych izolatów ze średnicą strefy od 18 do 20 mm w celu ustalenia, czy próbki o krótszym czasie inkubacji mogły spowodować nieokreślony rozmiar strefy. Spośród 34 próbek, które mieściły się w zakresie strefy nieokreślonej, 3 (9%) miały czas inkubacji od 10 do 15 h, 9 (26%) inkubowano od 15 do 20 h, a 22 (65%) inkubowano od 20 do 24 h. Nie stwierdzono korelacji między czasem inkubacji a średnicą strefy nieokreślonej; większość próbek nieokreślonych miała pełną inkubację między 20 a 24 h, przy czym <10% miało <15 h inkubacji.

Oceniając próbki na pacjenta, 39 ze 103 pacjentów miało MRSA, a 64 miało MSSA. Wykorzystując pierwszy pozytywny wynik posiewu krwi dla każdego pacjenta, 8 z 39 pacjentów z MRSA miało nieokreślone wyniki (średnica strefy między 18 a 20 mm), podobnie jak 2 z 64 pacjentów z MSSA. W ten sposób, oceniając pierwszy pozytywny wynik posiewu krwi pacjenta przy użyciu bezpośredniego testu dyskowego z cefoksytyną w celu określenia wyniku dla oksacyliny, 93 ze 103 (>90%) organizmów pacjentów zostałoby zakwalifikowanych ze 100% dokładnością przy użyciu parametrów średnicy strefy ≤17 mm dla MRSA i ≥21 mm dla MSSA, co jest bardzo bliskie 88% wartości obserwowanej podczas badania każdego posiewu krwi. Chociaż nie zaobserwowaliśmy żadnych mieszanych zakażeń MRSA i MSSA (jedno następowało po drugim w kolejnych pobraniach krwi na posiew), zalecamy badanie wszystkich „Gram-dodatnich kokcytów w skupiskach” z posiewów krwi bezpośrednim testem z krążkiem cefoksytyny, ponieważ taki scenariusz może wystąpić.

Potrzeba odróżnienia MRSA od MSSA z próbek krwi na posiew w odpowiednim czasie jest ważna dla zapewnienia najlepszej opieki pacjentom poprzez jak najszybsze zastosowanie odpowiednich antybiotyków. Kilka mechanizmów oznaczania gatunków Staphylococcus i/lub wyników oznaczania oksacyliny bezpośrednio z butelek z posiewem krwi obejmuje selektywne różnicowanie na agarze chromogennym (17), metody bezpośredniej identyfikacji, takie jak test BBL Crystal MRSA ID (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD) (11) oraz metody molekularne, w tym test BD GeneOhm StaphSR (Becton Dickinson, Sparks, MD), test Xpert MRSA/SA na posiew krwi firmy Cepheid (Sunnyvale, CA), multipleksowe wykrywanie mecA i genów nuc (12), wykrywanie genów mecA i orfX metodą PCR w czasie rzeczywistym (21) oraz test IDI w czasie rzeczywistym (Infectio Diagnostic, Sainte-Foy, Quebec, Kanada) przy użyciu urządzenia SmartCycler (Cepheid, Sunnyvale, CA) (7). Ponadto, test aglutynacji lateksowej PBP2a MRSA (Oxoid Ltd., Basingstoke, Wielka Brytania) mógłby być stosowany rano po subhodowli próbek dodatnich, jeżeli wystąpi wystarczający wzrost (zależnie od czasu inkubacji). Dałoby to podobny czas realizacji jak nasz protokół; jednakże test lateksowy PBP2a wymaga dobrze wyizolowanych kolonii, działa najskuteczniej, gdy jest wykonywany w partiach, wymaga dodatkowego czasu personelu do wykonania testu i jest bardziej kosztowny.

Wszystkie wymienione powyżej techniki wykorzystują dodatkowe zasoby laboratoryjne, takie jak systemy identyfikacji zestawów i/lub specjalistyczne media lub testy molekularne. Choć szybkie i dokładne, testy te są często najlepiej wykorzystywane do badania partii, są bardziej kosztowne i pracochłonne dla laboratorium, a w przypadku badań molekularnych często wymagają dodatkowej wiedzy i oprzyrządowania, które mogą nie być łatwo dostępne. W niniejszym opracowaniu przedstawiono metodę oznaczania stężenia oksacyliny w izolatach S. aureus bezpośrednio z próbek krwi pobranych na posiew, która może być stosowana w sposób ekonomiczny i dokładny, nie wymaga wykonywania testów seryjnych, ale może być odczytywana szybko i indywidualnie na każdym stanowisku pracy. Zrozumiałe jest, że laboratorium badałoby wszystkie posiewy krwi, w których stwierdzono występowanie gram-dodatnich pałeczek w skupiskach, ale ponieważ materiały i doświadczenie potrzebne do wykonania bezpośredniego testu z użyciem krążka cefoksytyny są już częścią rutynowego laboratorium mikrobiologii diagnostycznej, dodatkowy koszt płytki z podłożem tryptic soy blood agar i krążka z cefoksytyną jest warty niewielkiego wydatku (∼$0,50/SA posiewu) w celu szybszego wykrywania MSSA lub MRSA z posiewów krwi. W przypadku bezpośrednich wyników na krążkach cefoksytyny o wielkości strefy ≤17 mm lub ≥21 mm, dokładność raportowania wyników oznaczeń oksacyliny dla izolatów S. aureus wynosiła 100%. Dzięki zastosowaniu tego protokołu laboratorium może podać dokładny wynik oznaczenia oksacyliny do 24 godzin szybciej niż w przypadku oczekiwania na zakończenie rutynowych oznaczeń lekowrażliwości. Należy zauważyć, że te punkty załamania zostały ustalone na podstawie wyników tego badania i nie pokrywają się dokładnie z punktami opublikowanymi przez CLSI dla oceny oporności na oksacylinę przy użyciu krążków z cefoksytyną z izolowanych kolonii gronkowców (4). Ponadto, ponieważ badanie to nie było oparte na wytycznych CLSI, do użycia wybrano agar z krwią zamiast klasycznego agaru Mueller-Hinton wykorzystywanego w standardowych protokołach badawczych, ponieważ agar z krwią był tańszy (o około 40% w naszej instytucji) i byłby łatwiej dostępny dla laboratoriów, które głównie używają zautomatyzowanych urządzeń do oznaczania wrażliwości.

Dzięki szybszemu zgłaszaniu wyników oznaczania oksacyliny dla izolatów S. aureus z przypadków bakteriemii, pacjenci mogliby być wcześniej leczeni najbardziej skutecznym antybiotykiem. Odpowiednie i szybkie leczenie pacjenta najskuteczniejszym antybiotykiem zmniejszy ilość powikłań u pacjenta, skróci czas pobytu w szpitalu, zmniejszy zachorowalność i śmiertelność pacjentów, co w efekcie przyniesie większe oszczędności dla instytucji medycznych (10, 14, 15, 18). Ponadto, bardziej odpowiednie stosowanie wankomycyny zmniejszy pojawienie się oporności na ten lek u organizmów gram-dodatnich (2, 9).

• Copyright © 2008 American Society for Microbiology

.