54.9.5 Structure-Activity Aspects of the Cbl Transporters
Faktor wewnątrzpochodny wiąże B12 ze stałą dysocjacji przekraczającą 1012 mol/L.361 W porównaniu do haptokoryny, czynnik wewnątrzpochodny jest unikalny w dwóch aspektach. Wiąże on B12, ale nie szerokie spektrum korrinoidów rozpoznawanych przez haptokorynę, i w przeciwieństwie do haptokoryny nie jest trawiony przez enzymy obecne w górnym odcinku przewodu pokarmowego. Cechy te zapewniają, że tylko formy B12 rozpoznawane przez czynnik wewnętrzny są przedstawiane do wchłonięcia w końcowym odcinku jelita krętego. Czynnik wewnątrzpochodny jest białkiem o jednym łańcuchu aminokwasowym o masie ~ 50 kDa (417 aminokwasów). Białko to może rozpadać się na dwie części: 30 kDa N-końcowy fragment i 20 kDa C-końcowy fragment. Co ciekawe, każda z tych dwóch części rozpoznaje B12, ale jeśli są one razem w roztworze, to wiążą tylko jedną cząsteczkę B12.338 Odkrycia te są zgodne z trójwymiarową strukturą czynnika wewnętrznego, która pokazuje, że B12 jest umieszczony pomiędzy N-końcową podjednostką α i C-końcową podjednostką β327,335 (ryc. 54.15). Struktura trójwymiarowa oferuje również wyjaśnienie odkrycia, że okrojony o 20-50 aminokwasów C-końcowy czynnik wewnątrzpochodny nie wykazuje już wiązania B12 z wysokim powinowactwem.362 C-końcowa część cząsteczki zawiera wszystkie wiązania wodorowe i większość wiązań hydrofobowych zaangażowanych w rozpoznawanie B12 przez podjednostkę β cząsteczki.
Od dawna powszechnie wiadomo, że czynnik wewnątrzpochodny będzie rozpoznawał formy B12 z różnymi ligandami górnymi w porównywalny sposób (np, Met-B12 w porównaniu z CN-B12) i zgodnie z tą wiedzą przewidywana struktura krystaliczna pokazuje, że górny ligand jest wystawiony na działanie rozpuszczalnika.305,327 Specyficzność dla B12 napotykana przez czynnik wewnątrzpochodny w porównaniu z haptokoryną może być wyjaśniona obecnością nieporęcznych aminokwasów takich jak tryptofan i tyrozyna w kieszeni wiążącej B12 haptokoryny, ale nie czynnika wewnątrzpochodnego.327
Około 10 pacjentów z mutacjami w genie GIF kodującym czynnik wewnątrzpochodny zostało opisanych, ale takie mutacje nie przyczyniły się do naszego zrozumienia relacji struktura-funkcja dla wiązania B12 do czynnika wewnątrzpochodnego, ponieważ większość z nich jest wyjaśniona przez dwie specyficzne mutacje nonsensowne.323,363 Obecnie nie jest jasne, czy zamiana aminokwasu numer pięć z kwasu glutaminowego na argininę jest związana z upośledzoną funkcją czynnika wewnątrzpochodnego.327,364
Faktor wewnątrzpochodny jest glikoproteiną, a struktura węglowodanowa jest uważana za ważną dla jego stabilności w kierunku degradacji enzymatycznej, chociaż jest to niewystarczająco zbadane częściowo dlatego, że struktura węglowodanowa ludzkiego czynnika wewnątrzpochodnego pozostaje do wyjaśnienia. Wykorzystując szczurzy czynnik wewnątrzpochodny, wykazano, że cząsteczka węglowodanowa nie ma znaczenia dla rozpoznawania B12 lub wiązania czynnika wewnątrzpochodnego z jego receptorem.365
Struktura receptora kubiliny jest raczej unikalna. Cubilin rozpoznaje czynnik wewnątrzpochodny, podczas gdy amnionless zapewnia zakotwiczenie w błonie i zdolność endocytarną poprzez dwa sygnały sekwencji aminokwasowej fenyloalanina-any-asparagina-prolina-any-fenyloalanina (FXNPXF) w obrębie domeny cytozolowej. Te dwa sygnały promują internalizację całego kompleksu poprzez wiązanie się z białkami sortującymi związanymi z klatryną: disabled-2 (Dab2) i autosomalną recesywną hipercholesterolemią (ARH).366 Bezmembranowa część kubamu została zidentyfikowana na podstawie analizy równowagi sprzężeń u pacjentów z zespołem Imerslunda-Gräsbecka, którzy nie nosili mutacji w genie kubiliny, a później kilka mutacji w bezmembranowej części kubamu zostało powiązanych z tą chorobą, ze skupiskami w Norwegii i w regionach śródziemnomorskich.325,344 Dokładne badania na myszach i na modelu psa prezentującym spontaniczne mutacje w genie amnionless wykazały, że białko to jest niezbędne nie tylko do internalizacji ligandów związanych z kubiliną, ale także do eskortowania kubiliny na powierzchnię komórek.316,367 Wynik ten sugeruje, że kubam nie ulega ekspresji na powierzchni komórek, jeśli amnionless jest upośledzony, a w konsekwencji absorpcja B12 jest upośledzona.368
Częścią kubamu, która rozpoznaje czynnik wewnętrzny B12 jest kubilina. Kompleks ten został skrystalizowany (ryc. 54.15).342 Podjednostki β- i α czynnika wewnątrzpochodnego uczestniczą w wiązaniu zależnym od wapnia, które wymaga również obecności B12, jak wcześniej przewidywano w badaniach nad wiązaniem dwóch podjednostek czynnika wewnątrzpochodnego z kubiliną.339 N-końcowa część kubiliny obejmująca domeny CUB 5-8 jest odpowiedzialna za rozpoznawanie czynnika wewnętrznego, a struktura krystaliczna wskazuje, że domenami wiążącymi są CUB 6 i CUB 8342,369 Znaczenie CUB 5-8 opiera się na obserwacji, że mutacja kubiliny wymieniająca prolinę na leucynę w pozycji 1297 upośledza wiązanie pomiędzy kubiliną a czynnikiem wewnętrznym.370 Ta szczególna mutacja została zaobserwowana u fińskich pacjentów cierpiących na zespół Imerslunda-Gräsbecka, chociaż szereg innych mutacji w kubilinie również zostało powiązanych z tą chorobą.325
Ale chociaż zależność struktura-funkcja dla wiązania czynnika wewnętrznego z kubiliną została dobrze udokumentowana, znacznie mniej wiadomo o specyfice wiązania innych białek z kubiliną. W nerce receptor kubiliny bierze udział w proksymalnej reabsorpcji różnych białek, w tym białka wiążącego witaminę D (Gc), transferyny i albuminy (przegląd patrz Ref. 326). W konsekwencji wielu pacjentów z zespołem Imerslunda-Gräsbecka wykazuje zwiększone wydalanie niektórych z tych białek z moczem. Badania wyjaśniające związek między specyficznymi zmianami w kubilinie a białkami występującymi w moczu mogą ujawnić dodatkowe zależności struktura-funkcja.