Edukacja i wczesna kariera
Fleming był siódmym z ośmiorga dzieci szkockiego farmera (trzecim z czworga dzieci drugiej żony farmera). Jego wiejskie wychowanie w południowo-zachodniej Szkocji już w młodym wieku wyostrzyło jego zdolności obserwacji i doceniania świata przyrody. Naukę w szkole podstawowej rozpoczął w Loudoun Moor, a następnie przeniósł się do większej szkoły w Darvel, po czym w 1894 roku zapisał się do Kilmarnock Academy. W 1895 roku przeniósł się do Londynu, aby zamieszkać ze starszym bratem Thomasem (który pracował jako okulista) i ukończył swoją podstawową edukację na Regent Street Polytechnic.
Po pracy jako urzędnik żeglugi w Londynie, Fleming rozpoczął studia medyczne w St. Mary’s Hospital Medical School w 1901 roku, finansowane przez stypendium i spadek po wuju. Tam też zdobył w 1908 roku złoty medal jako najlepszy student medycyny na Uniwersytecie Londyńskim. Początkowo planował zostać chirurgiem, ale tymczasowa praca w laboratoriach Zakładu Szczepień w St. Mary’s Hospital przekonała go, że jego przyszłość leży w nowej dziedzinie, jaką jest bakteriologia. Tam znalazł się pod wpływem bakteriologa i immunologa Sir Almrotha Edwarda Wrighta, którego idee terapii szczepionkowej wydawały się oferować rewolucyjny kierunek w leczeniu.
W latach 1909-1914 Fleming założył udaną prywatną praktykę jako wenerolog, a w 1915 roku ożenił się z Sarah Marion McElroy, irlandzką pielęgniarką. Syn Fleminga, Robert, urodzony w 1924 roku, podążył za ojcem w kierunku medycyny. Fleming był jednym z pierwszych lekarzy w Wielkiej Brytanii, którzy podawali arfenaminę (Salvarsan), lek skuteczny w walce z syfilisem, odkryty przez niemieckiego naukowca Paula Ehrlicha w 1910 roku. Podczas I wojny światowej Fleming był członkiem Królewskiego Wojskowego Korpusu Medycznego i pracował jako bakteriolog badający infekcje ran w laboratorium, które Wright założył w szpitalu wojskowym mieszczącym się w kasynie w Boulogne we Francji. Wykazał tam, że stosowanie silnych środków antyseptycznych na rany przynosiło więcej szkody niż pożytku i zalecił, aby rany były po prostu czyszczone łagodnym roztworem soli fizjologicznej. Fleming powrócił do St. Mary’s po wojnie i awansował na asystenta dyrektora Departamentu Szczepień. Lata później, w 1946 roku, zastąpił Wrighta na stanowisku dyrektora wydziału, który został przemianowany na Instytut Wrighta-Fleminga.
W listopadzie 1921 roku Fleming odkrył lizozym, enzym obecny w płynach ustrojowych, takich jak ślina i łzy, który ma łagodne działanie antyseptyczne. To było pierwsze z jego głównych odkryć. Stało się tak, gdy był przeziębiony i kropla jego śluzu z nosa spadła na płytkę z kulturami bakterii. Zdając sobie sprawę, że jego śluz może mieć wpływ na wzrost bakterii, wymieszał śluz z kulturą i kilka tygodni później zauważył oznaki rozpuszczenia bakterii. Badania Fleminga nad lizozymem, które uważał za swoją najlepszą pracę naukową, stanowiły znaczący wkład w zrozumienie, w jaki sposób organizm zwalcza infekcje. Niestety, lizozym nie miał wpływu na najbardziej patogenne bakterie.