Rapid Differentiation of Methicillin-Staphylococcus aureus resistente e Staphylococcus aureus sensível à meticilina de culturas sanguíneas através da utilização de um teste directo de difusão do disco de cefoxitina

A incidência de infecções da corrente sanguínea por Staphylococcus aureus adquiridas na comunidade e cuidados de saúde aumentou significativamente ao longo das últimas décadas (20). O relatório do Sistema Nacional de Vigilância de Infecções Nosocomiais de Janeiro de 1992 a Junho de 2001 declarou que mais de 55% dos isolados de S. aureus eram resistentes à meticilina, oxacilina, ou nafcilina (16). Os factores de risco associados à bacteremia de S. aureus resistente à meticilina (MRSA) incluem o seguinte: residência numa instalação de cuidados prolongados, exposição prévia a antibióticos, diabetes insulino-dependente, hospitalização prolongada, cateterização urinária, colocação de sonda nasogástrica, cirurgia prévia, e ter uma doença subjacente (13, 18, 19). A população idosa (≥65 anos de idade) tem um risco significativamente maior de morte devido à bacteremia por MRSA do que as populações mais jovens (18, 22).

Infecção com MRSA coloca um doente em risco acrescido de novos problemas de saúde. A bacteremia por MRSA tem sido associada a um risco acrescido de insuficiência renal aguda, maior permanência no hospital e na unidade de terapia intensiva, desenvolvimento de dependência do ventilador, e aumento dos custos hospitalares (1, 6, 15). Vários estudos demonstraram que os doentes com infecções da corrente sanguínea por MRSA apresentam um risco significativamente mais elevado de mortalidade do que os doentes com infecções da corrente sanguínea por S. aureus sensíveis à meticilina (MSSA) (1, 5, 19). As taxas de mortalidade dos doentes que desenvolvem bacteremia por MRSA estão estimadas entre 23% e 54% (1, 8).

As doentes com bacteremia por MRSA também têm demonstrado um risco acrescido de atraso no tratamento (15). As escolhas inadequadas de antibióticos para doentes com bacteremia de S. aureus também têm sido associadas a taxas de mortalidade hospitalar mais elevadas (10). As terapias inadequadas consistiram em β-lactams para bacteremia de MRSA e vancomicina para bacteremia de MSSA. A escolha inicial da vancomicina para a bacteremia de MSSA tem sido associada a uma maior incidência de atraso na eliminação da infecção, e a terapia apropriada retardada para doentes com MRSA é um preditor independente de mortalidade (10, 15).

A escolha da terapia para infecções da corrente sanguínea tornou-se crítica com a crescente resistência aos antibióticos observada com muitos organismos. O aumento de organismos gram-positivos resistentes à vancomicina ameaça muitos regimes de tratamento aceites e justifica a utilização empírica de glicopeptídeos para infecções da corrente sanguínea (12). Assim, a caracterização mais rápida dos isolados de S. aureus das culturas de sangue como sendo resistentes à oxacilina ou susceptíveis à oxacilina é um factor importante no tratamento rápido e preciso de doentes bacterémicos.

Amostras de culturas de sangue foram colhidas em garrafas aeróbias e anaeróbias (garrafas BacT/Alert FA e BacT/Alert FN; bioMérieux, Durham, NC) e ensaiadas no BacT/Alert 3D (bioMérieux, Durham, NC). Amostras de culturas de sangue que mostravam “cocos gram-positivos em aglomerados” nas colorações de Gram foram embebidas num esfregaço a partir de uma alíquota derivada do frasco de sangue, utilizando a mesma técnica que se utilizaria na preparação de um teste de susceptibilidade de difusão em disco (3). O esfregaço foi então utilizado para estriar toda a superfície de uma placa de ágar de sangue de soja tripé de 100 mm (BD BBL, Franklin Lakes, NJ), como também seria feito para um teste de difusão em disco. Posteriormente, um disco de cefoxitina (BBL Sensi-Disc, Franklin Lakes, NJ) foi colocado no centro da placa, e as placas foram incubadas durante a noite (10 a 24 h) a 35 a 37°C no ar ambiente. Na manhã seguinte, os tamanhos das zonas de cefoxitina foram medidos e registados. Os resultados medidos do tamanho da zona de cefoxitina foram comparados com os resultados obtidos com testes de confirmação. Os ensaios de confirmação incluíram o teste de susceptibilidade do organismo isolado à oxacilina tanto pelo cartão de susceptibilidade Vitek 2 GP-63 (bioMéreiux, Durham, NC) como pelo teste de difusão do disco de cefoxitina padronizado (3, 4). Os organismos foram identificados como S. aureus por um teste de coagulase em tubo de 4-h realizado directamente a partir do caldo de cultura de sangue; as identificações foram relatadas no mesmo dia em que a cultura de sangue foi determinada como sendo positiva. Se a coagulase directa do tubo foi negativa, o teste de lâmina e/ou coagulase do tubo foi realizado em colónias isoladas na manhã seguinte, quando foram lidos os tamanhos da zona de cefoxitina.

Foram testadas 782 amostras de hemocultura, 276 das quais cultivaram uma cultura pura de S. aureus (de 103 pacientes). Um total de 489 amostras cultivaram estafilococos coagulase negativos (CNS), 12 cultivaram espécies de Micrococcus, 4 cultivaram S. aureus e CNS, e 1 cultivou espécies de Micrococcus e CNS. Das 276 culturas puras de S. aureus, 105 (38,1%) tinham tamanhos de zonas de cefoxitina directa que mediam ≤17 mm, 18 (6,5%) tinham as que mediam 18 mm, 8 (2,9%) tinham as que mediam 19 mm, 8 (2,9%) tinham as que mediam 20 mm, e 137 (49,6%) tinham as que mediam ≥21 mm (Fig. 1). Todas as amostras que tinham tamanhos de zona que mediram ≤17 mm com o teste directo do disco de cefoxitina foram confirmadas como sendo resistentes à oxacilina por ambos os métodos de confirmação, e todas as amostras com tamanhos de zona que mediram ≥21 mm com o teste directo do disco de cefoxitina foram confirmadas como sendo susceptíveis à oxacilina por ambos os métodos de confirmação. Assim, a detecção de MRSA ou MSSA em culturas de sangue poderia ser relatada 10 a 24 h antes para 88% das culturas com precisão total.

Trinta e quatro amostras com tamanhos de zona que mediram entre 18 e 20 mm continham uma combinação de isolados tanto de MRSA como de MSSA. Destas 34 amostras, 29 (85,3%) foram confirmadas como MRSA, e 5 (14,7%) foram confirmadas como MSSA. Esta faixa de tamanho de zona foi então descrita como “indeterminada”, uma vez que os resultados da oxacilina para organismos que caem nesta faixa não puderam ser confirmados por testes directos do disco de cefoxitina com 100% de precisão, mas devem aguardar a realização de testes de confirmação. Poder-se-ia até considerar chamar todos os organismos com diâmetros de zona entre 18 e 20 mm como MRSA presuntivo, uma vez que mais de 85% destas amostras foram determinadas como sendo MRSA após a realização de testes de confirmação. Estes intervalos de zona (MRSA, ≤20 mm; MSSA, ≥21 mm) tornariam a exactidão do teste directo do disco de cefoxitina >96%.

Tempos de incubação foram avaliados para todos os isolados de estudo com diâmetros de zona de 18 a 20 mm para determinar se as amostras com tempos de incubação mais curtos eram susceptíveis de resultar em tamanhos de zona indeterminados. Das 34 amostras que caíram na gama de zonas indeterminadas, 3 (9%) tiveram tempos de incubação de 10 a 15 h, 9 (26%) foram incubadas entre 15 e 20 h, e 22 (65%) foram incubadas entre 20 a 24 h. Não houve correlação entre tempos de incubação e diâmetros de zona indeterminados; a maioria das amostras indeterminadas tiveram incubações completas entre 20 e 24 h, com <10% tendo <15 h de incubação.

Avaliando amostras por paciente, 39 dos 103 pacientes tinham MRSA, e 64 tinham MSSA. Utilizando a primeira hemocultura positiva para cada paciente, 8 dos 39 pacientes com MRSA tiveram resultados indeterminados (diâmetros de zona entre 18 e 20 mm), tal como fizeram 2 dos 64 pacientes com MSSA. Assim, avaliando a primeira hemocultura positiva do doente com o teste directo de cefoxitina em disco para determinar o resultado da oxacilina, 93 dos 103 (>90%) organismos dos doentes teriam sido chamados com 100% de exactidão, utilizando os parâmetros de ≤17-mm de diâmetros de zona para MRSA e ≥21-mm de diâmetros de zona para MSSA, o que se aproxima muito dos 88% observados ao testar cada hemocultura. Embora não tenhamos visto quaisquer infecções mistas de MRSA e MSSA (uma seguida da outra em saques subsequentes de culturas sanguíneas), recomendamos que se testem todos os “cocos gram-positivos em aglomerados” das culturas sanguíneas com o teste directo do disco de cefoxitina, pois este cenário poderia ocorrer.

A necessidade de diferenciar o MRSA do MSSA das amostras de culturas sanguíneas de forma atempada é importante para proporcionar o melhor cuidado aos doentes através do uso de antibióticos apropriados o mais rapidamente possível. Vários mecanismos para determinar os resultados de Staphylococcus e/ou oxacillin directamente a partir de frascos de hemocultura incluem a diferenciação selectiva do ágar cromogénico (17), métodos de identificação directa como o teste BBL Crystal MRSA ID (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD) (11), e métodos moleculares, incluindo o ensaio BD GeneOhm StaphSR (Becton Dickinson, Sparks, MD), teste de cultura de sangue Xpert MRSA/SA de Cepheid (Sunnyvale, CA), detecção multiplex de mecA e dos genes nuc (12), detecção dos genes mecA e orfX por PCR em tempo real (21), e o ensaio IDI em tempo real (Infectio Diagnostic, Sainte-Foy, Quebec, Canadá) utilizando o SmartCycler (Cepheid, Sunnyvale, CA) (7). Além disso, o teste de aglutinação PBP2a MRSA em látex (Oxoid Ltd., Basingstoke, Reino Unido) poderia ser utilizado na manhã seguinte à subcultura de amostras positivas se ocorrer um crescimento suficiente (dependente do tempo de incubação). Isto daria um tempo de viragem semelhante ao nosso protocolo; contudo, o teste de látex PBP2a requer colónias bem isoladas, funciona de forma mais eficiente quando em lotes, leva tempo adicional de pessoal para testar, e é mais dispendioso.

Todas as técnicas mencionadas acima utilizam recursos laboratoriais adicionais, tais como sistemas de identificação de kits e/ou meios especializados ou ensaios moleculares. Embora rápidos e precisos, estes testes são muitas vezes melhor utilizados para testes de lote, são todos mais dispendiosos e de mão-de-obra intensiva para o laboratório, e, com testes moleculares, podem muitas vezes requerer conhecimentos moleculares adicionais e instrumentação que podem não estar prontamente disponíveis. Este estudo delineia uma abordagem para determinar o resultado da oxacilina de S. aureus isola directamente de amostras de hemocultura que podem ser utilizadas de forma rentável e precisa e não precisam de ser testadas por lotes, mas podem ser lidas rápida e individualmente em cada estação de trabalho. Compreensivelmente, o laboratório estaria a testar todas as culturas de sangue mostrando cocos gram-positivos em aglomerados, mas como os materiais e conhecimentos necessários para realizar o teste directo do disco de cefoxitina já fazem parte do laboratório de microbiologia de diagnóstico de rotina, o custo adicional de uma placa de ágar-ágar de sangue de soja triáptica e de um disco de cefoxitina vale bem a modesta despesa (∼$0,50/SA cultura) a fim de relatar MSSA ou MRSA mais rapidamente a partir de culturas de sangue. Para os resultados directos do disco de cefoxitina de ≤17-mm ou ≥21-mm tamanhos de zona, a exactidão da notificação dos resultados da oxacilina para isolados de S. aureus foi de 100%. Utilizando este protocolo, o laboratório pode dar um resultado preciso de oxacilina até 24 h mais rapidamente do que esperar que as susceptibilidades de rotina sejam completadas. É de notar que estes pontos de ruptura foram determinados pelos resultados deste estudo e não coincidem exactamente com os publicados pelo CLSI para avaliação da resistência à oxacilina utilizando discos de cefoxitina de colónias isoladas de estafilococos (4). Além disso, como este estudo não se baseou nas directrizes do CLSI, o ágar sangue foi escolhido para utilização em vez do clássico ágar Mueller-Hinton utilizado em protocolos de testes padronizados, uma vez que o ágar sangue era menos caro (em aproximadamente 40% na nossa instituição) e estaria mais prontamente disponível para laboratórios que utilizam principalmente instrumentos automatizados para testes de susceptibilidade.

Ao relatar mais rapidamente os resultados de oxacilina para isolados de S. aureus de casos de bacteremia, os pacientes poderiam ser tratados mais cedo com o antibiótico mais eficaz. O tratamento adequado e rápido de um doente com o antibiótico mais eficaz diminuirá as complicações para o doente, reduzirá o tempo de hospitalização do doente, e diminuirá a morbilidade e mortalidade do doente, resultando em maiores poupanças para as instituições médicas (10, 14, 15, 18). Além disso, o uso mais apropriado de vancomicina diminuirá a emergência de resistência a este medicamento em organismos gram-positivos (2, 9).

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