h3>54.9.5 Aspectos Estrutura-Actividade dos Transportadores Cbl
Factor intrínseco liga B12 com uma constante de dissociação superior a 1012 mol/L.361 Em comparação com a haptocorrina, o factor intrínseco é único em dois aspectos. Liga B12 mas não o largo espectro de corrinoides reconhecidos pela haptocorrina, e ao contrário da haptocorrina, não é digerido pelas enzimas presentes no tracto gastrointestinal superior. Estas características asseguram que apenas as formas de B12 reconhecidas por factor intrínseco são apresentadas para absorção no íleo terminal. O factor intrínseco é uma proteína de cadeia de um aminoácido que é ~ 50 kDa (417 aminoácidos). A proteína pode desintegrar-se em duas partes: um fragmento terminal de 30 kDa N e um fragmento terminal de 20 kDa C. Curiosamente, cada uma destas duas partes reconhece a B12, mas se juntas em solução, os parceiros conjuntos ligam apenas uma molécula de B12.338 Estas descobertas estão de acordo com a estrutura tridimensional do factor intrínseco que mostra a B12 a ser colada entre o terminal N α-subunit e o terminal C β-subunit327,335 (Fig. 54.15). A estrutura tridimensional também oferece uma explicação para a descoberta de que um factor intrínseco truncado de 20-50 aminoácido C-terminal já não mostra uma ligação de alta afinidade de B12.362 A parte terminal C da molécula contém todas as ligações de hidrogénio e a maioria das ligações hidrofóbicas envolvidas no reconhecimento de B12 pela subunidade da molécula β-subunidade.
Há muito que é do conhecimento geral que o factor intrínseco reconhecerá as formas de B12 com diferentes ligandos superiores de forma comparável (por exemplo Met-B12 em comparação com o CN-B12) e de acordo com este conhecimento a estrutura cristalina prevista mostra o ligante superior a ser exposto ao solvente.305,327 A especificidade de B12 encontrada pelo factor intrínseco em comparação com a haptocorrina pode ser explicada pela presença de aminoácidos volumosos como o triptofano e a tirosina na bolsa de ligação de B12 da haptocorrina mas não do factor intrínseco.327
Aproximadamente, foram descritos 10 pacientes com mutações na codificação do gene GIF para o factor intrínseco, mas tais mutações não contribuíram para a nossa compreensão das relações estrutura-função para ligação de B12 ao factor intrínseco, uma vez que a maioria deles é explicada por duas mutações específicas sem sentido.323,363 Actualmente, não é claro se uma troca do aminoácido número cinco de um ácido glutâmico para a arginina está relacionada com uma função prejudicada do factor intrínseco.327,364
O factor intrínseco é uma glicoproteína, e acredita-se que a estrutura dos hidratos de carbono seja importante para a sua estabilidade em direcção à degradação enzimática, embora isto não seja suficientemente examinado, em parte porque a estrutura dos hidratos de carbono do factor intrínseco humano ainda não foi elucidada. Utilizando o factor intrínseco dos ratos, foi demonstrado que a moety de hidratos de carbono não tem importância para o reconhecimento de B12 ou para a ligação do factor intrínseco ao seu receptor.365
A estrutura do receptor cubam é bastante única. A cubilina reconhece o factor intrínseco, enquanto que a amnionless fornece ancoragem da membrana e capacidade endocítica através de dois sinais de sequência de aminoácidos fenilalanina-ana-paragina-ana-fenilalanina (FXNPXF) dentro do domínio citosólico. Os dois sinais promovem a internalização de todo o complexo através da ligação às proteínas de triagem associadas à clatrina incapacitadas-2 (Dab2) e à hipercolesterolemia autossómica recessiva (ARH).366 A parte sem amnião do cubam foi identificada com base na análise de equilíbrio de ligação de doentes com síndrome de Imerslund-Gräsbeck que não abrigou mutações no gene da cubilina e, mais tarde, várias mutações no amnião sem amnião foram relacionadas com esta doença com clusters na Noruega e nas regiões mediterrânicas.325,344 Estudos elaborados em ratos e num modelo de cão que apresenta mutações espontâneas no gene sem âmnios mostraram que a proteína é essencial não só para a internalização dos ligandos ligados à cubilina, mas também para acompanhar a cubilina até à superfície das células.316,367 O resultado implica que nenhum cubam é expresso na superfície celular se o amnionless for prejudicado e, como consequência, a absorção de B12 é comprometida.368
A parte do cubam que reconhece o factor intrínseco B12 é a cubilina. O complexo foi cristalizado (Fig. 54.15).342 As subunidades β- e α-subunidades do factor intrínseco participam na ligação dependente do cálcio que também requer a presença de B12 como anteriormente previsto por estudos sobre a ligação das duas subunidades do factor intrínseco à cubilina.339 A parte N-terminal da cubilina incluindo os domínios CUB 5-8 é responsável pelo reconhecimento do facto intrínseco e a estrutura cristalina indica que os domínios de ligação são CUB 6 e CUB 8342,369 A importância de CUB 5-8 baseia-se na observação de que a mutação de cubilina trocando a prolina com a leucina na posição 1297 compromete a ligação entre a cubilina e o factor intrínseco.370 Esta mutação particular foi observada em doentes finlandeses que sofrem da síndrome de Imerslund-Gräsbeck, embora uma série de outras mutações na cubilina também tenham sido relacionadas com a doença.325
Embora a relação estrutura-função para a ligação do factor intrínseco à cubilina tenha sido bem documentada, sabe-se muito menos sobre a especificidade da ligação de outras proteínas à cubilina. No rim, o receptor cubam participa na reabsorção proximal de uma variedade de proteínas, incluindo a proteína de ligação à vitamina D (Gc), transferrina, e albumina (para revisão ver Ref. 326). Consequentemente, muitos doentes com síndrome de Imerslund-Gräsbeck apresentam um aumento da excreção de algumas destas proteínas na urina. Estudos que esclarecem a relação entre alterações específicas na cubilina e as proteínas que ocorrem na urina podem revelar relações estrutura-função adicionais.