Op deze tekening van de Franse kunstenaar Jacques le Moyne de Morgues vluchten Timucua voor de Spaanse kolonisten, die per schip arriveerden. Le Moyne woonde in Fort Caroline, de Franse buitenpost, voordat de Spanjaarden de kolonie in 1562 verwoestten.
Spanje kreeg voet aan de grond in het huidige Florida en zag dat gebied en de landen ten noorden ervan als een logische uitbreiding van hun Caraïbische rijk. In 1513 claimde Juan Ponce de León het gebied rond het huidige St. Augustine voor de Spaanse kroon en noemde het land Pascua Florida (Bloemenfeest, of Pasen) naar de dichtstbijzijnde feestdag. Ponce de León slaagde er niet in om er een permanente nederzetting te vestigen, maar tegen 1565 had Spanje een buitenpost nodig om het hoofd te bieden aan de Franse en Engelse kapers die Florida gebruikten als uitvalsbasis om met schatten beladen Spaanse schepen aan te vallen die van Cuba naar Spanje voeren. De bedreiging van de Spaanse belangen nam een nieuwe wending in 1562 toen een groep Franse protestanten (Hugenoten) een kleine nederzetting stichtten die zij Fort Caroline noemden, ten noorden van St. Met toestemming van Koning Philip II, leidde de Spaanse edelman Pedro Menéndez een aanval op Fort Caroline, waarbij de meeste kolonisten werden gedood en het fort werd vernietigd. De vernietiging van Fort Caroline diende een tweeledig doel voor de Spanjaarden: het gevaar van Franse kapers werd verminderd en de Franse dreiging voor de Spaanse aanspraak op het gebied werd weggenomen. De strijd om Florida illustreert hoe Europese rivaliteiten oversloegen naar de Amerika’s, met name religieuze conflicten tussen katholieken en protestanten.
In 1565 stichtte de zegevierende Menéndez St. Augustine, nu de oudste Europese nederzetting in de Amerika’s. Daarbij verdreven de Spanjaarden de plaatselijke Timucua-indianen uit hun oude stad Seloy, die al duizenden jaren bestond. De Timucua leden sterk onder de ziekten die door de Spanjaarden werden geïntroduceerd en hun aantal slonk van ongeveer 200.000 vóór het contact tot 50.000 in 1590. In 1700 waren er nog maar duizend Timucua over. Net als in andere gebieden die door de Spanjaarden waren veroverd, trachtten katholieke priesters een spirituele verovering tot stand te brengen door de overlevende Timucua, die gedemoraliseerd waren en leden onder de catastrofale verliezen van familie en gemeenschap, te dwingen zich tot het katholicisme te bekeren.
Spaans Florida was een uitnodigend doelwit voor de imperiale rivalen van Spanje, vooral de Engelsen, die toegang wilden krijgen tot het Caribisch gebied. In 1586 ontdekten de Spaanse kolonisten in St. Augustine hoe kwetsbaar ze waren voor aanvallen toen de Engelse piraat Sir Francis Drake de stad verwoestte met een vloot van twintig schepen en honderd man. In de daaropvolgende decennia bouwden de Spanjaarden meer houten forten, die allemaal door Europese rivalen in brand werden gestoken. Tussen 1672 en 1695 bouwden de Spanjaarden een stenen fort, Castillo de San Marcos, om St. Augustine beter te kunnen verdedigen tegen uitdagers.
Het Spaanse fort Castillo de San Marcos hielp de Spaanse kolonisten in St. Augustine om plunderende kapers uit rivaliserende Europese landen af te weren.