U.S. Food and Drug Administration

ITG SUBJECT: BACTERIËLE ENDOTOXINES/PYROGEN

Inleiding

In de literatuur is de laatste tijd veel te doen geweest over de Bacteriële Endotoxinen-test, de betekenis en interpretatie daarvan, en de vergelijking met de USP konijnentest. Het onderwerp werd eerder kort behandeld in Inspection Technical Guide No. 32, gedateerd 1/12/79, met als onderwerp: Pyrogenen, nog steeds een gevaar.

Omdat de Bacterial Endotoxins Test steeds meer geaccepteerd en gebruikt wordt, wordt ITG No. 32 geactualiseerd.

De USP erkent nu twee testen – De Pyrogeen Test uitgevoerd met konijnen en de Bacterial Endotoxins Test, ook wel de Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Test genoemd. Bovendien heeft het agentschap het gebruik van de bacteriële endotoxinetest voor veel geneesmiddelen en hulpmiddelen goedgekeurd. Deze ITG zal zich richten op de betekenis en interpretatie van pyrogeen/endotoxine testen. Ook bronnen en methoden van depyrogenatie zullen worden besproken. De beperkingen van de pyrogeentest met konijnen moeten worden onderkend bij het beoordelen van systemen tijdens inspecties van fabrikanten van steriele geneesmiddelen en hulpmiddelen.

Geschiedenis

In het Federal Register van 18 januari 1980 werden richtlijnen voorgesteld voor het bepalen van endotoxinen met de Limulus Amebocyte Lysate Test (LAL). Vervolgens werd de ontwerp-richtlijn herzien en opnieuw uitgegeven in 1983. In USP XX, 5e supplement, werd de Bacteriële Endotoxinen Test herzien. In tegenstelling tot de ontwerp-richtsnoeren van de FDA werden echter geen bepalingen inzake hertesten opgenomen. De meeste fabrikanten zijn in een bepaald stadium van de validatie van de Bacterial Endotoxin Test voor hun producten.

Het subcomité van de USP dat verantwoordelijk is voor herzieningen van compendiale testmethoden en/of productmonografieën heeft de afgelopen jaren enkele belangrijke wijzigingen aangebracht in de vereisten voor de bacteriële endotoxinetest en de productmonografie. In 1984 werden voor vijf USP-waterproducten specifieke grenswaarden voor bacteriële endotoxine vastgesteld. Water voor injectie, steriel water voor injectie en steriel water voor irrigatie hebben een toelaatbare endotoxine-grenswaarde van 0,25 endotoxine-eenheden (EU)/ml. (EU= meeteenheid voor endotoxineactiviteit). Bacteriostatisch water voor injectie en steriel water voor inhalatie hebben echter een iets hogere grenswaarde voor bacteriële endotoxine van 0,5 EU/ml gekregen (USP – Supplement 4a – 1984). Het agentschap heeft de voordelen van de Bacterial Endotoxins Test erkend, met name wat betreft gevoeligheid, reproduceerbaarheid, reikwijdte en eenvoud. Bovendien hebben zowel FDA-inspecties als FDA-testprogramma’s laakbare niveaus van endotoxine in geneesmiddelen en hulpmiddelen geïdentificeerd.

Sommige geteste eindproducten, hoewel niet bruikbaar bevonden vanwege de lage dosis toe te dienen product, zouden indicatief kunnen zijn voor pyrogeenproblemen in andere systemen, zoals een Water for Injection-systeem. Een bepaald product, zoals Cyanocobalamine Inj., kan bijvoorbeeld een endotoxineconcentratie van 10 EU/ml hebben en als conform worden beschouwd. Men zou echter vraagtekens kunnen zetten bij het Water for Injection (WFI) System van de fabrikant, aangezien het WFI System een niveau van .25 EU/ml zou moeten hebben.

Er is in de literatuur veel discussie over endotoxiciteit versus pyrogeniciteit. Veel van de FDA-onderzoekers en beoordelaars van inspectieverslagen zijn zich niet bewust van de beperkingen van de USP konijnentest als endotoxinetest. Bijvoorbeeld, Elin, in de Annual Review of Medicine, merkt op dat “De herhaalde toediening van lipopolysaccharide (LPS), de chemische naam die synoniem gebruikt wordt met bacteriële endotoxinen, aan proefdieren resulteert in een progressieve vermindering van sommige van de biologische effecten, vooral koorts. Het precieze mechanisme van dit verschijnsel, dat endotoxinetolerantie wordt genoemd, is onbekend”. Ook is uit sommige studies gebleken dat het endotoxine van de legionellabacil een ander spectrum van toxiciteit heeft dan dat van de meer gebruikelijke gramnegatieve organismen. Met name het legionella-endotoxine was niet erg pyrogeen (bij de konijnentest), maar was zeer actief in de LAL – 1.000-voudig verschil tussen beide tests. In deze situatie is de konijnentest ontoereikend voor het bepalen van de potentie van de aanwezige toxinen.

De USP pyrogeentest heeft naast de tolerantie voor endotoxine en de lage reactiviteit voor legionnaires’ endotoxine nog andere beperkingen. Een van deze beperkingen is de variabiliteit van de testresultaten in vergelijking met hetzelfde preparaat van gestandaardiseerde endotoxine. Deze wordt beïnvloed door seizoensvariatie, interlaboratoriumfactoren, kenmerken van soort tot soort bij konijnen, en andere biologische invloeden. De test is ongeschikt voor bepaalde klassen geneesmiddelen, waaronder radiofarmaca, chemotherapeutica voor kanker, hypnotica en narcotica, vitaminen, steroïden en bepaalde antibiotica. Gebleken is dat schijnbare pyrogenen in het product kunnen worden “gemaskeerd” door de fysisch-chemische activiteit van de therapeutische geneesmiddelbestanddelen. Bovendien is de konijnentest onvoldoende gevoelig voor de detectie van endotoxine in intrathecale geneesmiddelen.

Er is ook weinig erkenning van de klinische betekenis van endotoxine. Mogelijk komt dit doordat het meest benadrukte pathogene effect van gramnegatieve ziekte de productie van koorts is, en van alle effecten van endotoxine is koorts biologisch en klinisch waarschijnlijk het minst belangrijk.

Hoewel veel fabrikanten met LAL werken, zijn er nog steeds fabrikanten die aarzelen om LAL te gebruiken omdat het te gevoelig is.

Naast de gevoeligheid van de test, kunnen grotere aantallen doseringseenheden/apparaten worden getest met behulp van LAL. Zo bleek een steriel kritisch hulpmiddel een aanvaardbaar endotoxineniveau te hebben uit een gepoold monster. (NB: De USP pyrogeentest wordt uitgevoerd op een mengmonster.) Toen uittreksels van eenheden afzonderlijk met LAL werden getest, werden echter af en toe mislukkingen geconstateerd. Een soortgelijke situatie deed zich voor bij een monster van bacteriostatisch water voor injectie. Een gepoold monster van een aantal eenheden bleek een endotoxinegehalte van minder dan 0,5 EU/ml te hebben. Bij een aantal specifieke doseringseenheden werd echter een overschrijding van deze USP-limiet van 0,5 EU/ml gevonden en er werden wettelijke maatregelen getroffen.

Karakteristieken van bacteriële endotoxine

“Microbieel pyrogeen” in tegenstelling tot “gramnegatieve bacteriële endotoxine” is een algemene beschrijvende term geworden voor veel verschillende stoffen. Pyrogene stoffen kunnen echter worden geproduceerd door sommige grampositieve bacteriën, mycobacteriën, schimmels en ook virussen, maar de pyrogenen die worden geproduceerd door gramnegatieve bacteriën, d.w.z. de endotoxinen, zijn van belang voor de farmaceutische industrie.

Bacteriële endotoxinen, die worden aangetroffen in het buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, behoren tot een klasse fosfolipiden die lipopolysacchariden (LPS) worden genoemd. LPS zijn geen exogene producten van gramnegatieve bacteriën. Het vrijkomen van LPS uit bacteriën vindt plaats na de dood en lysis van de cel. Goede voorbeelden van pyrogeen producerende gram-negatieve bacteriën zijn Escherichia coli, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter en Klebsiella.

De formule die wordt gebruikt om de endotoxine limiet voor individuele geneesmiddelen te berekenen

De effecten van endotoxine zijn gerelateerd aan de hoeveelheid endotoxine in de productdosis die aan een patiënt wordt toegediend. Omdat de dosis van product tot product verschilt, wordt de endotoxinegrens uitgedrukt als K/M. K is 5,0 EU/kilogram (kg.), wat bij benadering overeenkomt met de drempelwaarde voor pyrogeen bij mensen en konijnen. Dat is het niveau waarop een product als pyrogeen of niet-pyrogeen wordt beoordeeld. M staat voor de pyrogeentestdosis voor konijnen of de maximale menselijke dosis per kilogram die in één periode van één uur zou worden toegediend, waarbij de hoogste waarde van toepassing is. Als een product voor intrathecale injectie is bestemd, is K 0,2 EU/kg. Er zijn echter 5 waterproducten (eerder besproken) die, vanwege de grote volumes die kunnen worden toegediend en het ontbreken van een dosisbeperking, specifieke endotoxinegrenzen per ml hebben.

Voorbeeld 1 – Een niet-intrathecaal geneesmiddel met een maximale humane dosis van 10 ml/kg.

Endotoxinegrens = K 5 EU/kg – = ——- = 0,5 EU/ml M 10 ml/kg

Voorbeeld 2 – Product: Cyanocobalamine Inj. Potentie: 1000 mcg/ml

Maximale dosis/kg 14,3 mcg/kg (zie etikettering van het product)

Endotoxine tolerantiegrens = 5,0 EU/kg – niet-intrathecaal geneesmiddel

Endotoxine grens = K 5.0 EU/kg – = ——— = 0,35 EU/mcg M 14,3 mcg/kg

Deze waarde (0,35 EU/mcg) wordt uitgedrukt in Endotoxine Eenheden per mcg product. Om deze waarde om te rekenen naar een endotoxine-eenhedenconcentratie per ml, vermenigvuldigt u deze (0,35 EU/mcg) met de potentie van het product (zie hieronder).

1000 mcg/ml x 0,35 EU/mcg = 350 EU/ml

Deze vastgestelde waarde betekent dat als een fabrikant van parenterale geneesmiddelen de LAL-methode gebruikt voor endotoxinetests op Cyanocobalamine Inj, het product niet meer dan 350 EU/ml product mag bevatten.

LAL Methoden – Enkele Inherente Zwakke punten

De FDA en USP hebben de geldigheid erkend van verschillende benaderingen voor het gebruik van LAL voor endotoxine testen. Er zijn vier basismethoden die in de handel verkrijgbaar zijn en momenteel door de FDA zijn goedgekeurd voor het testen op het vrijkomen van eindproducten: (i) de gel-clot; (ii) de turbidimetrische (spectrofotometrische); (iii) de colorimetrische (Lowry proteïne); en (iv) de chromogene assay. De bij deze methoden gebruikte LAL-reagentia moeten worden betrokken bij een fabrikant met een FDA-vergunning en moeten specifiek voor de gekozen methode zijn ontworpen. Veel van de andere LAL-methoden in de literatuur zijn modificaties van de gel-clot of turbidimetrische test en sommige zijn zodanig ontworpen dat minder LAL wordt gebruikt dan bij de basismethode.

Van bepaalde producten is bekend dat zij interfereren met het vermogen van de LAL om met endotoxine te reageren. Deze factoren kunnen van chemische of fysische aard zijn. Chemische remmers veroorzaken chelatie van tweewaardige kationen die nodig zijn voor de LAL-reactie (d.w.z. EDTA), denaturatie van eiwitten (d.w.z. fluoresceïne), of verstoring van de pH (d.w.z. pH buiten het 6,0 – 7,5 bereik). Fysische remmers zijn onder meer adsorptie van endotoxine of viscositeit van het product. De meeste zijn van invloed op alle methoden, hoewel de mate van remming kan variëren. De meeste remmingen kunnen echter worden opgeheven door verdunning van het product. Andere factoren zoals de vorm en het type van het glaswerk dat bij de gel-klontertest wordt gebruikt, kunnen ook van invloed zijn op de geldigheid van de test. Zo kunnen bijvoorbeeld gesiliconiseerd glaswerk en plastic de gel-klontervorming remmen of een nauwkeurige spectrofotometrische aflezing van het eindpunt van het reactiemengsel verhinderen.

Turbidimetrische en chromogene methoden kunnen niet worden gebruikt met bepaalde troebele of gekleurde producten. Bovendien kan neerslagvorming, hoewel remmend, bij deze methoden worden aangezien voor een positieve reactie. Een probleem bij het gebruik van de chromogene methode is de vorming van een neerslag na de toevoeging van zuur om de kleurontwikkeling te stoppen. Producten die een neutrale of basische pH vereisen om oplosbaar te zijn, zullen dit probleem waarschijnlijk veroorzaken.

De noodzaak om de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van de LAL-methode voor elk getest product te valideren, kan niet genoeg worden benadrukt. Fabrikanten kunnen dit aantonen door het product te enten met lage endotoxineconcentraties en te testen op de recovery daarvan. De gebruikte endotoxineconcentraties moeten binnen het onderste bereik van de gevoeligheid van het lysaat liggen. Bovendien hebben verschillende onderzoekers geconstateerd dat zelfs de keuze van de bron van het lysaatreagens (d.w.z. de fabrikant van het lysaat) kan bijdragen tot variabiliteit in de testresultaten. Daarom moet de test opnieuw worden gevalideerd als een verandering in de reagensbron wordt aangebracht.

Er zijn verschillende herzieningen geweest in de analytische procedures die in de bacteriële endotoxinetest worden beschreven sinds deze voor het eerst werd uitgegeven in 1980. Deze wijzigingen hebben ervoor gezorgd dat de LAL-methode betrouwbaarder is geworden als compendiale referentietest. De belangrijkste wijzigingen zijn (i) na verdunning van endotoxine door een parallelle reeks oplossingen, waarvan de ene water bevat en de andere pH-gecorrigeerd product, mag het eindpunt voor de reactiemengsels tussen de twee reeksen niet meer dan een factor twee verschillen; (ii) als het product van invloed is op het lysaat-testmengsel, kan elke verdunning tussen het remmingseindpunt en de MVD worden gebruikt; (iii) het maximum aan verdunning van een product voor de test moet worden bepaald met behulp van de formule voor de maximale geldige verdunning (MVD). De formule is gebaseerd op de productdosering, de tolerantiegrens voor endotoxinen en de gevoeligheid van het lysaat. Als het product meer dan deze vastgestelde factor wordt verdund, heeft een negatief resultaat geen betekenis meer. Schadelijke endotoxineconcentraties kunnen worden verdund tot onder het detecteerbare bereik van het lysaat; iv) Vage procedures voor het wassen van bacteriële endotoxinen uit producten van medische hulpmiddelen. Zorgvuldige aandacht voor het niet gebruiken van te grote volumes voor het spoelen van producten wordt genoemd.

Bronnen

Er kunnen verschillende bronnen van pyrogenen in parenterale producten en producten voor medische hulpmiddelen zijn. Gebruikelijke bronnen zijn: het water dat als oplosmiddel of bij de verwerking wordt gebruikt; verpakkingscomponenten; de chemicaliën, grondstoffen of apparatuur die bij de bereiding van het product worden gebruikt. Een goede praktijk zou inhouden dat de microbiologische en endotoxineniveaus van de besmetting in de hierboven genoemde potentiële bronnen worden gecontroleerd.

Voor parenterale producten is bij inspecties gebleken dat wanneer pyrogeenproblemen werden aangetroffen in doseringsvormen, en wanneer de bron een van de grondstoffen was, het de werkzame stof betrof. Dit gold met name voor geneeskrachtige stoffen waarbij in een laat stadium van het syntheseproces proceswater werd gebruikt. De endotoxineniveaus van de geneesmiddelsubstantie werden vervolgens verlaagd wanneer de microbiologische niveaus van het proceswater werden verlaagd en het proceswatersysteem werd gecontroleerd.

Extra, als de geneesmiddelsubstantie biologisch wordt geproduceerd, kan de onvolledige verwijdering van het micro-organisme tijdens de zuivering ertoe leiden dat de geneesmiddelsubstantie hoge endotoxineniveaus heeft. Voorbeelden hiervan zijn antibiotica die worden geproduceerd door middel van fermentatie of de bijproducten van gramnegatieve bacteriën die worden gebruikt voor de productie van genetisch gemanipuleerde geneesmiddelen. Het mogelijke gebruik van gist op dit gebied wordt geëvalueerd om dit probleem te elimineren.

Algemene verwerkingsprocedures voor fysieke onderdelen van parenterale producten, zoals stoppen en flacons, voorzien in het wassen van deze onderdelen met pyrogeenvrij water voorafgaand aan sterilisatie. Een goede praktijk is dat de onderdelen na het wassen zo weinig mogelijk worden aangeraakt en onmiddellijk worden gesteriliseerd, vooral als ze met stoom worden gesteriliseerd. Opslag van niet-steriele natte stoppers kan leiden tot een toename van micro-organismen en mogelijk endotoxineniveaus.

Een andere bron van endotoxinen is het Water for Injection (WFI) of pyrogeenvrij watersysteem. Een algemene opmerking is dat circulerende warmwatersystemen (boven 75 C) de omgeving bieden die het minst bevorderlijk is voor microbiële groei en endotoxinevorming. Circulerende water voor injectiesystemen bij lagere temperaturen (bij ongeveer 60 C) worden enigszins (marginaal) gecontroleerd door de temperatuur van het systeem. Er bestaat enige bezorgdheid over het feit dat sommige pathogene gramnegatieve organismen, zoals Legionella pneumophilia, zullen overleven en groeien bij 57 C. Er is veel informatie over de aanwezigheid van L. pneumophilia in warmwatersystemen voor ziekenhuizen. Uit de literatuur is gebleken dat het periodiek verhogen van de temperatuur van deze warmwatersystemen tot 75 – 80 C het organisme heeft geëlimineerd.

In het algemeen vormen WFI-systemen met omgevingstemperatuur het grootste probleem. Veel van de verwerpelijke micro-organismen die goede bronnen van endotoxinen zijn, groeien goed in koude WFI-systemen. Dit geldt in het bijzonder voor omgekeerde osmose (RO) systemen. Erkend is dat, aangezien omgekeerde osmose filters niet absoluut zijn, het nodig kan zijn ze in serie te hebben om pyrogeenvrije WFI te produceren.

Zoals eerder besproken, draagt de groei van sommige soorten micro-organismen bij tot verhoogde endotoxineniveaus. Niet-steriele bulkoplossingen of geformuleerde oplossingen, met name de conserveervrije oplossingen, zijn een goede omgeving voor microbiële groei. Het is niet gebruikelijk dat fabrikanten endotoxinetests op deze oplossingen uitvoeren. De meeste voeren microbiologische tests uit om het microbiologische niveau (bio-belasting) te bepalen voordat de oplossing aan een sterilisatieproces wordt onderworpen. Om te bepalen of het endotoxinegehalte hoog kan zijn, is het echter raadzaam microbiologische tests uit te voeren voordat sterilisatiestappen worden uitgevoerd. Als een product bijvoorbeeld wordt geformuleerd en gefilterd voordat het definitief wordt gesteriliseerd, zal microbiologisch onderzoek van de bio-burden na filtratie enige nuttige informatie opleveren om te bepalen of het sterilisatieproces adequaat is verlopen. Het zal echter weinig of geen informatie opleveren over de geschiktheid van het proces met betrekking tot het minimaliseren van endotoxinebesmetting. Aangezien endotoxinen het gevolg zijn van hoge niveaus van micro-organismen en niet worden verwijderd door sterilisatie of microbiologische filters, zal de daaropvolgende verlaging van een hoog microbiologisch niveau niet gepaard gaan met een vergelijkbare verlaging van een hoog endotoxineniveau.

Zoals bij parenterale geneesmiddelen, is ook bij steriele hulpmiddelen af en toe aangetoond dat ze met endotoxinen zijn besmet. De bronnen zijn water dat op de een of andere manier in het fabricageproces is terechtgekomen. Bijvoorbeeld het wassen van componenten zoals filtermedia voor de vervaardiging van filters, of het wassen/spoelen van slangen of andere plastic hulpmiddelen voorafgaand aan de daaropvolgende sterilisatie zijn potentiële bronnen van endotoxinen.

Depyrogenering

Het is moeilijk om endotoxinen uit producten te verwijderen als ze eenmaal aanwezig zijn. Het is veel beter om eindproducten en componenten relatief endotoxinevrij te houden dan ze te moeten verwijderen als ze eenmaal aanwezig zijn.

De meest gangbare depyrogenatieprocedures voor fysieke componenten zijn verbranding en verwijdering door wassen, ook wel verdunning genoemd. Uit de literatuur is gebleken dat andere procedures, zoals filtratie, bestraling en ethyleenoxidebehandeling, slechts een beperkt effect hebben op de verlaging van het pyrogeen/endotoxinegehalte. Voor Water for Injection-systemen zijn de twee aanvaardbare fabricagemethoden distillatie en omgekeerde osmose.

Distillatie is doeltreffend gebleken en is de meest betrouwbare methode om endotoxine uit besmette watermonsters te verwijderen. Er zijn geïsoleerde problemen vastgesteld met betrekking tot spatten in de distilleerketel en de daaropvolgende verontreiniging van het distillaat. Ook zijn er incidentele problemen met condensors of warmtewisselaars geconstateerd. Zie ITG NO. 34, van 31.7.1979, voor een aanvullende bespreking van warmtewisselaars.

Zoals bij de meeste processen en apparatuur het geval is, is het een goede gewoonte om de beperkingen en/of mogelijkheden van de apparatuur te kennen. Zo is bijvoorbeeld gebleken dat distilleertoestellen met hoge endotoxineniveaus in het voedingswater soms WFI van onaanvaardbare kwaliteit opleveren ( >.25 EU/ml). Meer nog, wanneer WFI wordt geproduceerd door omgekeerde osmose (RO), moet het endotoxinegehalte van het voedingswater bekend zijn. Aangezien RO-filters niet absoluut zijn, kan het nodig zijn ze in serie te gebruiken om pyrogeenvrij WFI te produceren. Welk systeem ook wordt gebruikt, goede praktijken omvatten de mogelijkheid om elk onderdeel van de apparatuur in een WFI-systeem te isoleren en te evalueren. Zie ITG nr. 36, van 10/21/80, voor een bespreking van omgekeerde osmose.

Voor fysieke onderdelen, zoals stoppen en slangen, is spoelen of verdunnen met pyrogeenvrij water het meest gebruikelijk. Sommige fabrikanten, zoals LVP-fabrikanten, maken gebruik van verdunning om endotoxine te verwijderen uit glazen recipiënten die vervolgens op andere wijze worden gesteriliseerd. Net als bij de validatie voor steriliteit moet bij de validatie voor endotoxinereductie de endotoxinebelasting bekend zijn en moet de endotoxine-uitdaging bevredigend zijn. Wegens de geringe gevoeligheid van de USP pyrogeentest op konijnen moet de “challenge”-test worden uitgevoerd met de Limulus Amebocyte Lysate-test. Hoewel er op dit gebied geen gids is, wordt verwacht dat er tenminste een reductie van 3 log onder de endotoxine challenge is wanneer het verdunningsproces wordt gebruikt.

Historisch gezien zijn flacons of glazen componenten pyrogeenvrij gemaakt door droge hittesterilisatie bij hoge temperaturen. In sommige teksten wordt de depyrogenering van glaswerk en apparatuur aanbevolen door verhitting bij een temperatuur van 250 C gedurende 45 minuten. Er is gemeld dat 650 C gedurende 1 minuut of 180 C gedurende 4 uur eveneens pyrogenen vernietigt. Studies van Tsuji et al, gepubliceerd in 1978, hebben aangetoond dat bij lagere temperaturen (vanaf 170 C) de thermische vernietiging een tweede-ordetempo volgt, en dat een vermindering van het endotoxinegehalte met 3 log bij lagere temperaturen wellicht niet praktisch is.

Er zijn nog andere, minder gebruikelijke methoden om endotoxinen te verwijderen. Bij de vervaardiging van steriele poeders wordt meestal gebruik gemaakt van kristallisatie of zuivering om endotoxinen te verwijderen. Sommige fabrikanten hebben soms hun toevlucht genomen tot minder aanvaardbare methoden zoals het wassen of spoelen van het kristal of poeder met een oplosmiddel om endotoxinen te verwijderen.

NOOT: Het gebruik van verdunning of spoelen is aanvaardbaar voor een fysisch onderdeel zoals een stopper of flacon die niet zal worden geïnjecteerd. Wanneer het echter wordt gebruikt voor een chemisch onderdeel, is het slechts van beperkte waarde. Men kan er alleen zeker van zijn dat het endotoxinegehalte aan het buitenoppervlak van het poeder is verlaagd en niet in het gehele kristal.

Andere minder algemeen aanvaardbare methoden zijn behandeling met ethyleenoxide en bestraling. Gebleken is dat de pyrogene werking van E. coli endotoxine in dialysators na blootstelling aan ethyleenoxide met ongeveer 80% is afgenomen.

Wat de produktieapparatuur en de transferlijnen betreft, is depyrogenering door verdunning gewoonlijk de methode van keuze geweest. Het gebruik van een sterke alkali of een oxiderende oplossing is soms gebruikt om pyrogenen in deze opslag- en afgiftesystemen te verminderen. Dit moet echter worden gevolgd door spoeling met water voor injectie. Residuen in de spoeloplossing van minder dan 1 deel per miljoen (ppm) kunnen worden bereikt en zijn aanvaard.

Endotoxines and their Detection With the Limulus Amebocyte Lystate Test, Alan R. Liss, Inc., 150 Fifth Avenue, New York, NY (1982)

Novitsky, T.J., Monitoring and Validation of High Purity Water Systems with the Limulus Amebocyte Lystate Test for Pyrogens, Pharm. Eng., mrt-apr 1984, p. 21

Novitsky, T.J., LAL Methodology: De keuze is aan u, Med. Dev. and Diagn. Inst., 1984, p. 49

Novitsky, T.J., et al, Automated LAL Testing of Parenteral Drugs in the Abbott MS-2, J. Parent Sci Technol, 36 (1982), p. 11

Pharmacopeial Forum, “The New USP Reference Standard Endotoxin – A Collaborative Project”, Jan-Feb 1982, p. 1743

Pharmacopeial Forum, “Characterization of Rabbit Colonies for the Pyrogen Test”, sept-okt 1983, blz. 3559

Public Health Seervice, 1983 code of Federal Regulations, 48, Food and Drug Administration, blz. 13096

Tsuji, K. et al, Dry-Heat Destruction of Lipopolysaccharide, App. and Env. Microbial, 36:705-179, 1978

Twohy, C. et al, Comparison of Limulus Amebocyte Lysates from Different Manufacturers, J. Parent Sci Technol, 37 (1983), p. 93

The United States Pharmacopeia, 20th Rev, Mack Publishing Co., Easton, PA, p. 888 (1980)

Validation of Dry Heat Processess Used for Sterilization and Depyrogenation. Technisch Rapport Nr. 3, Parenteral Drug Assoc., 1981