Hoewel het klassieke model zeer nuttig is geweest voor het begrijpen van het differentiatieproces van HSC’s, is het vermeldenswaard dat dit model een aantal tekortkomingen heeft, in die zin dat het de complexiteit van hematopoëtische stam- en progenitorcellen (HSPC’s) oversimplificeert, en dat het alleen gebaseerd is op de oppervlaktemarkers en transplantatie met behulp van bulkcellen. Bulkcelanalyse gaat ervan uit dat elke cel, die hetzelfde fenotype heeft, een identieke functie heeft. Door de vooruitgang in de eencellige technologie en genetische muismodellen is dit klassieke model de laatste jaren op de helling komen te staan, vooral bij de opheldering van megakaryopoëse. Bovendien zijn nieuwe types HSPC’s geïdentificeerd en uitgebreid bestudeerd vanwege hun lineage biases.
Heterogeniteit in HSCs lineage output en debatten over megakaryocyt differentiatie
Met behulp van limiting-dilution analyse en single-cel transplantatie, definieerden de Sieburg en Eaves groepen myeloïde-biased (My-Bi), gebalanceerde (Ba) en lymfoïde-biased (Ly-Bi) HSCs op basis van de verhouding tussen myeloïde en lymfoïde cellen outputs (Muller-Sieburg et al., 2002; Muller-Sieburg et al., 2004; Dykstra et al., 2007; Benz et al., 2012) (Fig. 2A en 2B). Bovendien zijn bloedplaatjes-biased HSCs ook gerapporteerd als een My-Bi subset, verblijvend aan de top van de hematopoietische hiërarchie (Sanjuan-Pla et al., 2013) (Fig. 2C). Onderzoekers hebben het concept van LT-HSCs en ST-HSCs reeds lang erkend. Op basis van de reconstitutietijd zijn in verschillende laboratoria intermediate-term HSCs (IT-HSCs) gebruikt, die tussen LT-HSC en ST-HSC in zitten en tot 8 maanden na de transplantatie bijdragen aan de reconstitutie (Benveniste et al., 2010; Yamamoto et al., 2013). Bovendien volgden Lu et al. afzonderlijke HSC’s in vivo met behulp van virale genetische barcoding gecombineerd met high-throughput sequencing (Lu et al., 2011). Zij onthulden ook heterogeniteit in de HSC populatie. In deze test toonden zij aan dat HSC’s niet in gelijke mate bijdragen aan het nageslacht, en dat er twee verschillende HSC-differentiatiepatronen naast elkaar bestaan in dezelfde ontvangende muis na bestraling. Het ene differentiatiepatroon bestaat uit progenitorcelpopulaties waaronder GMP’s, MEP’s en CLP’s; de andere groep bestaat uit rijpe lymfoïde bloedcellen. Op dezelfde manier, met enkelvoudige celtransplantatie, zagen Yamamoto et al. dat zelfvernieuwende lineage-beperkte progenitors bestaan in fenotypisch gedefinieerde HSC, met megakaryocyte herpopulerende progenitors (MkRPs), megakaryocyte-erythrocyte herpopulerende progenitors (MERPs), en gewone myeloïde herpopulerende progenitors (CMRPs) (Yamamoto et al., 2013) (Fig. 2D). Deze studie suggereert dat oligo-, bi- en unipotente cellen naast elkaar bestaan in HSC populaties. Bovendien kunnen de SLAM familie markers CD150 en CD229 HSCs scheiden in verschillende fracties met differentiatie reconstitutie vermogen. Vergeleken met CD150med HSC, vertoonden CD150hi HSC een hoger zelfvernieuwend potentieel met myeloïde differentiatie (Morita et al., 2010). CD229- HSC’s hebben een langdurig zelfvernieuwend potentieel met myeloïde biased differentiatie en vormen alle andere stam- en progenitorcelpopulaties, terwijl CD229+ HSC’s minder zelfvernieuwend vermogen lijken te hebben met lymfoïde biased differentiatie (Oguro et al., 2013). De single-cell omics analyses (Moignard et al., 2013; Wilson et al., 2015; Nestorowa et al., 2016; Buenrostro et al, 2018; Laurenti en Gottgens, 2018; Jacobsen en Nerlov, 2019), waaronder single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) en single cell assay for transposase-accessible chromatin using sequencing (scATAC-seq), hebben de aanwezigheid van heterogeniteit in de meest primitieve HSC-populaties verder aan het licht gebracht.
(A) My-Bi en Ly-Bi HSC’s model. Ly-Bi HSC’s reconstitueren de myeloïde lineage in mindere mate dan de lymfoïde lineage, en vice versa. (B) Het laboratorium van Eaves heeft α-, β-, γ- en δ-cellen gedefinieerd volgens het percentage myeloïde chimerisme ten opzichte van het percentage lymfoïde chimerisme (M/L-verhouding). Een enkele donorcel wordt gedefinieerd als α-cellen wanneer de M/L-verhouding meer dan 2 bedraagt, β-cellen wanneer de M/L-verhouding meer dan 0,25 maar minder dan 2 bedraagt, en γ/δ-cellen wanneer zij minder dan 0,25 bedraagt. Daarom zijn α-cellen myeloïde, β-cellen evenwichtig, en γ/δ-cellen lymfoïde zonder 2e transplantatiemogelijkheid. (C) vWF+ bloedplaatjes-geïndiceerde HSC’s staan aan de top van de hiërarchie en kunnen differentiëren in alle progenitors en rijpe cellen. vWF- lymfoïde-geïndiceerde HSC’s bevinden zich stroomafwaarts van vWF+ HSC’s. LMPPs kunnen geen aanleiding geven tot de megakaryocyt/erythrocyt-lijn. MEP’s zijn rechtstreeks afgeleid van HSC’s. (D) In het myeloïde bypass-model bevat de LT-HSC-populatie CMRP’s, MERP’s, en MkRP’s. Deze MyRP’s worden rechtstreeks door HSC’s geproduceerd. (E) MPP-subtypes worden gescheiden in MPP1-4. MPP1 kan aanleiding geven tot alle lineages. MPP2/3 zijn myeloïde-biased en MPP4 is lymfoïde-biased. Bovendien is MPP2 gebaseerd op bloedplaatjes. (F) In dit model differentiëren de MPP’s in Pre MegE, Pre GM en CLP. Pre MegE is upstream van MkP en pre CFU-E. Pre GM geeft aanleiding tot GMP, en genereert vervolgens nieuw gedefinieerde neutrofiele precursors (Pre Neu)
De oorsprong van megakaryocyten is al enkele jaren onderwerp van discussie. De groep Jacobsen identificeerde lymfoïde-geprimeerde MPPs (LMPPs) die aanleiding geven tot granulocyt/macrofaag- en lymfoïde-lijngroepen, maar niet tot een megakaryocyt/erythrocyt-lijngroep (Adolfsson et al., 2005) (Fig. 2C). Studies naar lineage tracering weerleggen dit standpunt echter en suggereren dat LMPPs ook differentiëren in een megakaryocyt/erythrocyt lineage (Forsberg et al., 2006; Boyer et al., 2011). De verschillende resultaten kunnen worden toegeschreven aan de celdosis die voor de transplantatie wordt gebruikt en de methoden, met inbegrip van muismodellen, die in verschillende laboratoria worden gebruikt. Meer recent werd gesuggereerd dat mRNA-expressie van de megakaryocyt-marker von Willebrand factor (vWF) en de oppervlakte-receptor c-Kit indicatief zijn voor een bloedplaatjes-biased, maar multipotente HSC-subpopulatie (Sanjuan-Pla et al., 2013; Shin et al., 2014). Bewijs voor een bloedplaatjes-gebaseerde populatie van HSC’s werd geleverd door de Jacobsen groep (Sanjuan-Pla et al., 2013). Zij ontdekten dat 25% van de LT-HSC’s vWF tot expressie brengen en dat vWF+ HSC’s voorbestemd zijn voor bloedplaatjesspecifieke genexpressie, met een verhoogde neiging tot langdurige reconstitutie van bloedplaatjes. De vWF + bloedplaatjes-primed HSCs hebben ook een lange-termijn myeloïde lineage bias, kan zelfvernieuwing, en kan aanleiding geven tot vWF- lymfoïde-biased HSCs (Fig. 2C). Daarom staan de met bloedplaatjes geïmpregneerde HSC’s aan de top van de hematopoietische hiërarchie. Bovendien werd op basis van eencellige transplantatie-experimenten het bestaan van megakaryocyte-lineage beperkte cellen in het fenotypische HSC compartiment voorgesteld (Yamamoto et al., 2013). Paar-dochter celtransplantatie assay geeft aan dat megakaryocyte precursoren rechtstreeks afkomstig zijn van HSCs (Yamamoto et al., 2013) (Fig. 2D). Later rapporteerde een studie dat het HSC compartiment stam-achtige megakaryocyte committed progenitors (SL-MkPs) bevat, een celpopulatie die veel kenmerken deelt met HSCs (Haas et al., 2015). Deze populatie wordt geactiveerd bij ontstekingsstress om bloedplaatjes efficiënt aan te vullen, waardoor een potentiële kortere weg van HSC’s naar megakaryocyten is gesuggereerd onder ontstekingsomstandigheden (Haas et al., 2015). Bovendien, door het volgen van progenitors en volwassen lineage cellen geproduceerd uit enkele getransplanteerde HSCs, toonde een recent rapport van Jacobsen’s lab aan dat een aparte klasse van HSCs een lot aanneemt naar langdurige en effectieve aanvulling van megakaryocyten/plaatjes zonder aanvulling van andere bloedcel lineages, terwijl geen HSCs uitsluitend bijdragen aan een andere enkele bloedcel lineage (Carrelha et al, 2018).
Collectief delen HSC’s en megakaryocyten verschillende kenmerken, bijvoorbeeld expressie van trombopoëtine receptor (MPL), CD150, CXCR4 en vWF, etc. (Wang et al., 1998; Sugiyama et al., 2006; Pronk et al., 2007; Yoshihara et al., 2007; Huang en Cantor, 2009). Belangrijker nog, megakaryocyten dienen ook als een HSC niche component en reguleren nauwgezet het behoud van de HSC functie (Bruns et al., 2014; Zhao et al., 2014). Bloedplaatjes- en myeloïde-biased vWF+ HSC’s, maar niet lymfoïde-biased vWF- HSC’s, associëren met megakaryocyten en worden gereguleerd door megakaryocyten (Pinho et al., 2018). Al het bewijs suggereert dat HSCs en de megakaryocyt (of zijn progenitors) dichter bij elkaar staan in de hematopoietische ontwikkelingshiërarchie dan eerder werd gewaardeerd. Gezien de heterogeniteit die is waargenomen in de HSC-populatie, is onze mening dat lineage (celdoel) predeterminatie optreedt in HSCs, voorafgaand aan hun differentiatie naar progenitors. Bovendien kan de megakaryocyt onafhankelijk van andere lineages ontstaan, en wordt de megakaryocytendifferentiatieroute eerst gescheiden van andere bloedcellineliniages in de hiërarchie.
Heterogeniteit in MPPs
De Trumpp (Wilson et al., 2008) en Passegue (Pietras et al., 2015) groepen hebben de MPP-populatie verder onderverdeeld in MPP1, MPP2, MPP3 en MPP4 op basis van hun immuno-fenotype, celcyclusstatus, lineage bias, resistentie tegen medicamenteuze behandeling en beenmergabundantie. MPP1 lijkt meer op de eerder gedefinieerde IT-HSC of ST-HSC, die tot 4 maanden na de eerste transplantatie in staat zijn tot multi-lineage reconstitutie, terwijl MPP2/3/4 geen zelfvernieuwingspotentieel hebben en slechts op korte termijn in staat zijn tot myeloïde reconstitutie (<1 maand). Belangrijker is dat MPP2 en MPP3 lage niveaus van T- en B-cellen produceren en MPP4 lage niveaus van myeloide cellen in vivo genereert. Bovendien produceert MPP2, in vergelijking met MPP3 en MPP4, hogere gehaltes aan bloedplaatjes. Alles bij elkaar genomen is MPP2 een megakaryocyt-gebaseerde MPP-subgroep en MPP3 een myeloïde-gebaseerde MPP-subgroep. Zowel MPP2 als MPP3 zijn functioneel verschillend van de lymfoïde-geprimeerde MPP4. HSCs genereren onafhankelijk alle drie types van lineage-biased MPPs (MPP2-4), maar onder hen, geen MPPs zijn in staat om andere MPPs in vivo (Fig. 2E) te genereren. Na transplantatie produceren HSCs eerst myeloïde-gestimuleerde MPPs (MPP1/2) om snel myeloïde output tot stand te brengen, gevolgd door de lymfoïde-gestimuleerde MPP4 subpopulatie om het lymfoïde compartiment opnieuw op te bouwen. Daarom zijn MPP’s een heterogene populatie met verschillende lineage-biased potentieel zowel op cellulair als moleculair niveau.
Heterogeniteit en hiërarchie binnen myeloïde progenitors
In het klassieke model worden CMP’s en MEP’s gescheiden op basis van CD34 expressie. In de Lin-cKit+Sca1- (LKS-) populatie zijn CMPs CD34+CD16/32-, terwijl MEPs CD34-CD16/32- zijn. Aangenomen wordt dat CMP’s oligo-potentie bezitten, waaronder granulocyt-, macrofaag-, megakaryocyt- en erytrocyt-differentiatiepotentieel. CMPs hebben echter een lage klonale frequentie van gemengde myeloïde kolonies, en MEPs bezitten ook een laag megakaryocytenpotentieel (Nakorn et al., 2003). Daarom vraagt het ons te weten of elke CMP of MEP een verschillend lineage potentieel heeft op het niveau van de enkele cel, d.w.z,
Om de heterogeniteit en lineage commitment in de LKS- myeloide progenitor populatie te begrijpen, vooral in CMPs, gebruikten Pronk et al. (Pronk et al., 2007) CD150, CD105 (Endoglin), CD41 en CD16/32 om de LKS- myeloide progenitors te re-segregeren. In de LKS- populatie zijn CD41+CD150+ cellen gedefinieerd als megakaryocyte progenitors (MkPs), die uitsluitend geassocieerd zijn met de generatie van megakaryocyten. CD41-CD150- CD16/32+ cellen zijn GMPs. In de CD41-CD150-CD16/32- populatie (klassieke mengeling van CMP’s en MkP’s) zijn er vier nieuw gedefinieerde subpopulaties, waaronder pre-MegE’s, pre-GGP’s, pre-CBU-E’s en CFU-E’s (Pronk et al., 2007). Enkelvoudige Pre MegE-cellen kunnen effectief megakaryocytaire, erythroïde en gemengde megakaryocytaire/erythroïde kolonies produceren. Daarentegen ontstaan uit Pre CFU-E-cellen vrijwel uitsluitend erytroïde kolonies van verschillende grootte. Pre GMs liggen ontwikkelingsopwaarts van GMPs, en hebben een opmerkelijk vergelijkbare clonale lineage output als de GMPs. Daarom verkent de studie van Pronk et al. de processen van myeloïde celdifferentiatie, onthult een aantal nieuwe intermediaire progenitors, en orkestreert een nieuw hiërarchiemodel, inclusief unipotente proliferatieve neutrofiele precursors (Kim et al., 2017; Evrard et al., 2018; Zhu et al., 2018). Klassieke CMPs bestaan uit pre GMs, en de meerderheid van pre MegEs en MEPs zijn gescheiden in CFU-E, Pre CFU-Es, en een deel van pre MegEs. Bovendien bevinden MkP’s zich voornamelijk in CMP’s (Pronk et al., 2007) (Fig. 2F).
In lijn met het hierboven besproken werk, een mijlpaal paper van Amit’s lab dat de transcriptomen rapporteerde voor meer dan 2.600 muis single LKS- myelo-erythroid progenitorcellen (Paul et al, 2015) en een daaropvolgend werk van Gottgens’ lab dat de transcriptomen van 1.600 HSPCs rapporteerde (Nestorowa et al., 2016) onthulden beide heterogeniteit in LKS- progenitors. De enkele cellen van klassieke LKS- progenitors vertonen geen expressie van megakaryocyte markers of prominente megakaryocyte TF’s. Echter, zowel megakaryocyt markers (Pf4 en CD41) en TF’s (Pbx1, Fli1, Mef2c) komen tot expressie in de cellen van klassieke CMP’s (Paul et al., 2015).
Alle studies samen verklaren waarom megakaryocyten voornamelijk differentiëren van CMP’s, maar niet van MEP’s, en MEP’s meestal aanleiding geven tot erytrocyten. Daarom suggereert dit dat klassieke MEP’s misschien niet de echte voorloper zijn voor megakaryocyten.
Hematopoietische differentiatie is een continu proces
Vorige studies gaven aan dat individuele HSC’s geleidelijk lineage biases verwerven langs meerdere richtingen, terwijl ze discrete hiërarchisch georganiseerde progenitor populaties doorlopen (Fig. 3A). Deze modellen zijn echter gebaseerd op de analyse van vooraf gedefinieerde flow-gesorteerde celpopulaties. Met de vooruitgang in methodologieën, is het mogelijk geworden om de overeenkomsten of verschillen van individuele HSPCs en hun differentiatie relaties.
(A) Het discrete differentiatiemodel laat zien dat de differentiatie van HSC’s tot rijpe lineage de progressiecellen een stapsgewijs proces is volgens een boomachtige hiërarchie van oligo-, bi- en unipotente progenitors. (B) Het continue differentiatiemodel toont aan dat er geen duidelijke grens in de hiërarchie is. Individuele HSC’s verwerven geleidelijk lineage biases in meerdere richtingen zonder door discrete hiërarchisch georganiseerde progenitorpopulaties te gaan
Door gebruik te maken van scRNA-seq in combinatie met computationele analyse, een recente studie over HSPC’s uit het menselijke beenmerg, waarbij uitgebreide monsters zijn genomen, een model gesuggereerd waarin de verwerving van lineage-specifieke fates een continu proces is, en unilineage-beperkte cellen rechtstreeks voortkomen uit een continuüm van laag-geprimeerde ongedifferentieerde HSPC’s, zonder een grote overgang door de multi- en bi-potente stadia (Velten et al., 2017). Deze opvatting wordt ondersteund door een zebravisstudie die suggereerde dat het continuüm van HSPC-differentiatie wordt gekenmerkt door een sterk gecoördineerd transcriptioneel programma, dat gelijktijdige onderdrukking van celproliferatie-gerelateerde genen en upregulatie van lineage-specifieke genen vertoont (Macaulay et al., 2016). Bovendien suggereerde een andere studie met menselijke navelstrengbloed lymfo-myeloïde progenitorcellen, waaronder LMPP’s, GMP’s en multi-lymfoïde progenitors (MLP’s), verder een model waarin een continuüm van progenitors lymfoïde en myeloïde differentiatie uitvoert, in plaats van dat alleen unilineage progenitors stroomafwaarts van stamcellen aanwezig zijn (Karamitros et al., 2018). Hoewel de meeste progenitors unilineage potentieel hebben, zijn er bi- en oligo-lineage progenitors aanwezig onder LMPP’s, GMP’s en MLP’s. Deze bovengenoemde studies veranderen onze visie dat hematopoietische differentiatie een continu proces is, in plaats van een discrete hiërarchie, wat suggereert dat er geen duidelijke grens is tussen stamcellen en progenitors (Laurenti en Gottgens, 2018) (Fig. 3B).
De routekaart van menselijke hematopoëse
In menselijke hematopoëse sorteerde de Dick-groep MPP’s, CMP’s en MEP’s uit foetale lever en volwassen beenmerg, en vergeleek hun lineagepotentieel uit verschillende ontwikkelingsstadia (Notta et al, 2016). Zij toonden aan dat eerder gedefinieerde MPP’s, CMP’s en MEP’s heterogeen zijn. Belangrijk is dat MEP’s, van zowel foetale lever als beenmerg, uniform erythroid-only klonen produceren. Daarom zijn de klassiek gedefinieerde MEP’s voornamelijk erythroïde voorlopers wanneer ze geanalyseerd worden op enkelvoudige celresolutie en zijn ze geen megakaryocyte/erythroïde progenitors zoals eerder gedacht, wat consistent is met de observatie in een muismodel (Pronk et al., 2007). Interessant is dat foetale lever grote aantallen van verschillende oligopotente progenitors bevat. Er waren echter weinig oligopotente progenitors aanwezig in het volwassen beenmerg. In plaats daarvan overheersen slechts twee progenitorklassen, multipotente en unipotente, waarbij megakaryocyt/erythroïde lijngroepen voortkomen uit multipotente cellen. De studie van de groep Dick biedt een herzien model om normale hematopoëse te begrijpen, die inderdaad flexibel is in ontwikkelingstijd.