U.S. Food and Drug Administration

ITG SUBJECT: BACTERIAL ENDOTOXINS/PYROGENS

Introduzione

C’è stata recentemente una considerevole discussione in letteratura riguardante il test delle endotossine batteriche, il suo significato e la sua interpretazione, e il suo confronto con il test del coniglio USP. L’argomento è stato precedentemente affrontato brevemente tramite la Guida tecnica d’ispezione n. 32, datata 1/12/79, con l’oggetto: Pyrogens, Still a Danger.

A causa dell’aumento dell’accettazione e dell’uso del Bacterial Endotoxins Test, la ITG No. 32 viene aggiornata.

L’USP ora riconosce due test – il Pyrogen Test condotto con i conigli e il Bacterial Endotoxins Test, chiamato anche Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Test. Inoltre, l’agenzia ha approvato l’uso del test delle endotossine batteriche per molti prodotti farmaceutici e dispositivi. Questo ITG si concentrerà sul significato e sull’interpretazione dei test pirogeni/endotossine. Saranno discussi anche le fonti e i metodi di depigmentazione. Le limitazioni del test dei pirogeni del coniglio dovrebbero essere riconosciute quando si esaminano i sistemi durante le ispezioni dei produttori di farmaci e dispositivi sterili.

Storia

Il Federal Register, il 18 gennaio 1980, ha proposto delle linee guida per determinare le endotossine con il Limulus Amebocyte Lysate Test (LAL). Successivamente, la bozza di linee guida è stata rivista e ripubblicata nel 1983. L’USP XX, 5° supplemento, ha rivisto il test delle endotossine batteriche. Tuttavia, a differenza della bozza di linea guida della FDA, non sono state incluse disposizioni di ritest. La maggior parte dei produttori sono in una fase di convalida del Bacterial Endotoxin Test per i loro prodotti.

Il sottocomitato USP responsabile delle revisioni dei metodi di prova compendiali e/o delle monografie dei prodotti ha, negli ultimi anni, apportato alcuni cambiamenti significativi nel test dell’endotossina batterica e nei requisiti della monografia del prodotto. Nel 1984, cinque prodotti per l’acqua USP hanno ricevuto limiti specifici di endotossina batterica. L’acqua per iniezione, l’acqua sterile per iniezione e l’acqua sterile per irrigazione hanno un limite di endotossina consentito di 0,25 unità di endotossina (EU)/ml. (EU=Unità di misura per l’attività dell’endotossina). Tuttavia, all’Acqua Batteriostatica per Iniezione e all’Acqua Sterile per Inalazione è stato dato un limite di endotossina batterica leggermente più alto di 0,5 EU/ml (USP – Supplemento 4a – 1984). L’agenzia ha riconosciuto i vantaggi del test delle endotossine batteriche, in particolare per quanto riguarda la sensibilità, la riproducibilità, la portata e la semplicità. Inoltre, sia le ispezioni che i programmi di test della FDA hanno identificato livelli discutibili di endotossina in farmaci e dispositivi.

Alcuni prodotti finiti testati, anche se non sono risultati perseguibili a causa della bassa dose di prodotto da somministrare, potrebbero essere indicativi di problemi di pirogeno in altri sistemi, come un sistema Acqua per Iniezione. Per esempio, un particolare prodotto come Cianocobalamina Inj. può avere una concentrazione di endotossina di 10 EU/ml ed essere considerato conforme. Tuttavia, si potrebbe mettere in discussione il sistema WFI (Water for Injection) del produttore, poiché il sistema WFI dovrebbe avere un livello di .25 EU/ml.

C’è una notevole discussione in letteratura relativa all’endotossicità rispetto alla pirogenicità. Molti degli investigatori della FDA e dei revisori dei rapporti di ispezione non sono consapevoli delle limitazioni del test del coniglio USP come test dell’endotossina. Per esempio, Elin, nell’Annual Review of Medicine, ha commentato che “La somministrazione ripetuta di lipopolisaccaridi (LPS), il nome chimico usato come sinonimo di endotossine batteriche, ad animali da esperimento risulta in una progressiva diminuzione di alcuni effetti biologici, specialmente la febbre. Il meccanismo preciso di questo fenomeno, chiamato tolleranza all’endotossina, è sconosciuto”. Inoltre, alcuni studi hanno dimostrato che l’endotossina del bacillo dei legionari ha un diverso spettro di tossicità rispetto ai più comuni organismi gram-negativi. In particolare, l’endotossina dei legionari non era molto pirogenica (con il test del coniglio), ma era molto attiva nel LAL – 1.000 volte di differenza tra i due test. In questa situazione, il test del coniglio è inadeguato per determinare la potenza delle tossine presenti.

Il test pirogeno USP ha ulteriori limitazioni oltre alla tolleranza all’endotossina e alla bassa reattività all’endotossina dei legionari. Tra questi vi è la sua variabilità nei risultati del test rispetto alla stessa preparazione di endotossina standardizzata. Questa condizione è influenzata dalla variazione stagionale, da fattori interlaboratorio, dalle caratteristiche da specie a specie dei conigli e da altre influenze biologiche. Il test è inadeguato per alcune classi di farmaci tra cui radiofarmaci, agenti chemioterapici per il cancro, ipnotici e narcotici, vitamine, steroidi e alcuni antibiotici. È stato riscontrato che i pirogeni apparenti nel prodotto possono essere “mascherati” dall’attività fisico-chimica dei componenti del farmaco terapeutico. Inoltre, il test del coniglio non è sufficientemente sensibile per il rilevamento dell’endotossina nei prodotti farmaceutici intratecali.

C’è anche poco riconoscimento del significato clinico dell’endotossina. Probabilmente questo è dovuto al fatto che l’effetto patogeno più sottolineato delle malattie gram negative è la produzione di febbre, e di tutti gli effetti dell’endotossina, la febbre è probabilmente il meno importante dal punto di vista biologico e clinico.

Anche se molti produttori stanno lavorando con LAL, ci sono ancora alcuni produttori che sono riluttanti a utilizzare LAL perché è troppo sensibile.

In aggiunta alla sensibilità del test, un numero maggiore di unità di dosaggio/dispositivi può essere testato utilizzando LAL. Per esempio, un dispositivo critico sterile è risultato avere un livello di endotossina accettabile da un campione in comune. (Nota: il test dei pirogeni USP viene eseguito su un campione raggruppato.) Tuttavia, quando estratti di unità sono stati testati con LAL individualmente, sono stati notati fallimenti occasionali. Una situazione simile si è verificata in un campione di acqua batteriostatica per iniezione. Un campione raggruppato da un certo numero di unità è risultato avere livelli di endotossina inferiori a 0,5 EU/ml. Tuttavia, alcune unità di dosaggio specifiche sono state trovate a superare questo limite di 0,5 EU/ml USP ed è stata intrapresa un’azione normativa.

Caratteristiche dell’endotossina batterica

“Pirogeno microbico” in opposizione a “endotossina batterica gram negativa” è diventato un termine descrittivo generale per molte sostanze diverse. Tuttavia, le sostanze pirogene possono essere prodotte da alcuni batteri gram positivi, micobatteri, funghi e anche virus, ma i pirogeni prodotti dai batteri gram negativi, cioè le endotossine, sono importanti per l’industria farmaceutica.

Le endotossine batteriche, presenti nella membrana esterna dei batteri gram negativi, sono membri di una classe di fosfolipidi chiamati lipopolisaccaridi (LPS). Gli LPS non sono prodotti esogeni dei batteri gram negativi. Il rilascio di LPS dai batteri avviene dopo la morte e la lisi della cellula. Buoni esempi di batteri gram negativi produttori di pirogeni sono Escherichia coli, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter e Klebsiella.

Formula usata per calcolare il limite di endotossina per i singoli prodotti farmaceutici

Gli effetti dell’endotossina sono legati alla quantità di endotossina nella dose di prodotto somministrata a un paziente. Poiché la dose varia da prodotto a prodotto, il limite di endotossina è espresso come K/M. K è 5,0 EU/kilogrammo (kg.), che rappresenta la dose pirogena di soglia approssimativa per gli esseri umani e i conigli. Questo è il livello al quale un prodotto è giudicato pirogeno o non pirogeno. M rappresenta la dose del test pirogeno del coniglio o la massima dose umana per chilogrammo che verrebbe somministrata in un singolo periodo di un’ora, a seconda di quale sia la più grande. Se un prodotto è etichettato per l’iniezione intratecale, allora K è 0,2 EU/kg. Tuttavia, ci sono 5 prodotti per l’acqua (precedentemente discussi) che, a causa dei grandi volumi che possono essere somministrati e dell’assenza di limitazione della dose, hanno limiti di endotossina specifici per ml.

Esempio 1 – Un prodotto farmaceutico non intratecale che ha una dose umana massima di 10 ml/kg.

Limite di endotossina = K 5 EU/kg – = ——- = 0,5 EU/ml M 10 ml/kg

Esempio 2 – Prodotto: Cyanocobalamin Inj. Potenza: 1000 mcg/ml

Dose massima/kg 14,3 mcg/kg (vedi etichetta del prodotto)

Limite di tolleranza all’endotossina = 5,0 EU/kg – farmaco non intratecale

Limite di endotossina = K 5.0 EU/kg – = ——— = 0,35 EU/mcg M 14,3 mcg/kg

Questo valore (0,35 EU/mcg) è espresso in unità di endotossina per mcg di prodotto. Per convertire questo valore in una concentrazione di unità di endotossina per ml, moltiplicarlo (0.35 EU/mcg) per la potenza del prodotto (vedi sotto).

1000 mcg/ml x 0.35 EU/mcg = 350 EU/ml

Questo valore determinato significa che se un produttore di farmaci parenterali sta usando il metodo LAL per il test dell’endotossina della Cianocobalamina Inj, il prodotto non può avere più di 350 EU/ml di prodotto.

Metodi LAL – Alcune debolezze intrinseche

La FDA e l’USP hanno riconosciuto la validità di vari approcci all’uso di LAL per il test dell’endotossina. Ci sono quattro metodi di base disponibili in commercio e attualmente approvati dalla FDA per i test di rilascio dei prodotti finali: (i) il gel-clot; (ii) il turbidimetrico (spettrofotometrico); (iii) il colorimetrico (proteina Lowry); e (iv) il test cromogenico. I reagenti LAL utilizzati in questi metodi devono essere ottenuti da un produttore con licenza FDA e devono essere progettati specificamente per il metodo scelto. Molti degli altri metodi LAL che appaiono in letteratura sono modifiche del test gel-clot o turbidimetrico e alcuni sono stati progettati per utilizzare meno LAL del metodo di base.

Alcuni prodotti sono noti per interferire con la capacità del LAL di reagire con l’endotossina. Questi fattori possono essere chimici o fisici. Gli inibitori chimici causano la chelazione dei cationi divalenti necessari per la reazione LAL (es. EDTA), la denaturazione delle proteine (es. fluoresceina), o l’alterazione del pH (es. pH fuori dall’intervallo 6.0 – 7.5). Gli inibitori fisici includono l’assorbimento dell’endotossina o la viscosità del prodotto. La maggior parte influenzerà tutti i metodi anche se il grado di inibizione può variare. Tuttavia, la maggior parte dell’inibizione può essere superata dalla diluizione del prodotto. Anche altri fattori come la forma e il tipo di vetreria utilizzata nel test del gel-clot possono influenzare la validità del test. Per esempio, la vetreria siliconata e la plastica possono inibire la formazione di gel-clot o impedire letture spettrofotometriche accurate del punto finale della miscela di reazione.

I metodi turbidimetrici e cromogenici non possono essere utilizzati con alcuni prodotti torbidi o colorati. Inoltre, la formazione di precipitato, anche se inibitoria, può essere scambiata per una risposta positiva in questi metodi. Un problema associato all’uso del metodo cromogenico è la formazione di un precipitato dopo l’aggiunta di acido per fermare lo sviluppo del colore. I prodotti che richiedono un pH neutro o basico per la solubilità hanno maggiori probabilità di causare questo problema.

La necessità di convalidare l’affidabilità e l’accuratezza del metodo LAL per ogni prodotto testato non può essere enfatizzata troppo. I produttori possono dimostrarlo inoculando il prodotto con bassi livelli di endotossina e testandone il recupero. Le concentrazioni di endotossina utilizzate dovrebbero essere all’interno dell’intervallo inferiore della sensibilità del lisato. Inoltre, diversi ricercatori hanno scoperto che anche la selezione della fonte del reagente del lisato (cioè il produttore del lisato) può contribuire alla variabilità dei risultati del test. Pertanto, se viene apportato qualsiasi cambiamento nella fonte del reagente, il test deve essere riconvalidato.

Ci sono state diverse revisioni alle procedure analitiche descritte nel test dell’endotossina batterica da quando è stato pubblicato per la prima volta nel 1980. Queste modifiche hanno permesso al metodo LAL di essere più affidabile come test arbitrale compendiario. Le modifiche significative sono: (i) Dopo la diluizione dell’endotossina attraverso una serie parallela di soluzioni, una contenente acqua e l’altra prodotto regolato a pH, il punto finale per le miscele di reazione tra le due serie non dovrebbe differire di più di una differenza di due volte; (ii) Se il prodotto influisce sulla miscela di test del lisato, allora può essere utilizzata qualsiasi diluizione tra il punto finale di inibizione e la MVD; (iii) La massima diluizione di un prodotto per il test deve essere determinata utilizzando la formula di diluizione massima valida (MVD). La formula si basa sul dosaggio del prodotto, sul limite di tolleranza dell’endotossina e sulla sensibilità del lisato. La diluizione del prodotto oltre questo fattore determinato renderà un risultato negativo privo di significato. Le concentrazioni di endotossine dannose possono essere diluite al di sotto della gamma rilevabile del lisato; (iv) procedure vaghe per il lavaggio delle endotossine batteriche dai prodotti dei dispositivi medici. Viene menzionata un’attenta attenzione a non utilizzare volumi eccessivi per il risciacquo del prodotto.

Fonti

Ci possono essere diverse fonti di pirogeni nei prodotti parenterali e nei dispositivi medici. Le fonti usuali sono: l’acqua usata come solvente o nella lavorazione; i componenti dell’imballaggio; i prodotti chimici, le materie prime o le attrezzature usate nella preparazione del prodotto. Una buona pratica includerebbe il controllo dei livelli microbiologici e di endotossina della contaminazione nelle fonti potenziali menzionate sopra.

Per i prodotti parenterali, le ispezioni hanno mostrato che quando sono stati trovati problemi di pirogeno nelle forme di dosaggio, e quando la fonte era una delle materie prime, era la sostanza attiva del farmaco. Questo era particolarmente vero per le sostanze farmaceutiche in cui l’acqua di processo era usata in qualche fase avanzata del processo di sintesi. I livelli di endotossina della sostanza farmaceutica sono stati successivamente abbassati quando i livelli microbiologici dell’acqua di processo sono stati abbassati e il sistema dell’acqua di processo è stato controllato.

Inoltre, se la sostanza farmaceutica è prodotta biologicamente, la rimozione incompleta del microorganismo durante la purificazione può portare la sostanza farmaceutica ad avere alti livelli di endotossina. Gli esempi includono gli antibiotici prodotti per fermentazione o i sottoprodotti dei batteri gram negativi usati per produrre prodotti farmaceutici geneticamente modificati. L’uso potenziale del lievito in questo settore è in fase di valutazione per eliminare questo problema.

Le procedure di lavorazione generali per i componenti fisici dei prodotti parenterali, come tappi e fiale, prevedono il lavaggio di questi componenti con acqua priva di pirogeni prima della sterilizzazione. Una buona pratica includerebbe una manipolazione minima del componente dopo il lavaggio e una rapida sterilizzazione, in particolare se sterilizzato a vapore. La conservazione di tappi bagnati non sterili potrebbe portare ad un aumento dei microrganismi e forse dei livelli di endotossine.

Un’altra fonte di endotossine è l’acqua per iniezione (WFI) o il sistema di acqua apirogena. Come osservazione generale, i sistemi di acqua calda in circolazione (sopra i 75 C) forniscono l’ambiente meno favorevole alla crescita microbica e alla formazione di endotossine. I sistemi di acqua circolante per iniezione a temperature più basse (a circa 60 C) sono in qualche modo (marginalmente) controllati dalla temperatura del sistema. C’è una certa preoccupazione che ci possano essere alcuni organismi patogeni gram negativi, come la Legionella pneumophilia, che sopravvivono e crescono a 57 C. Ci sono molte informazioni sulla presenza di L. pneumophilia nei sistemi di acqua calda degli ospedali. La letteratura ha dimostrato che aumentare periodicamente la temperatura di questi sistemi di acqua calda a 75-80 C ha eliminato l’organismo.

Generalmente, i sistemi WFI a temperatura ambiente presentano il problema maggiore. Molti dei microrganismi discutibili che sono buone fonti di endotossine crescono bene nei sistemi WFI freddi. Questo è particolarmente vero per i sistemi a osmosi inversa (RO). È stato riconosciuto che, poiché i filtri a osmosi inversa non sono assoluti, potrebbe essere necessario averli in serie per produrre WFI apirogeno.

Come discusso in precedenza, la crescita di alcuni tipi di microorganismi contribuisce ad aumentare i livelli di endotossina. Le soluzioni in-processo o formulate non sterili, in particolare le soluzioni senza conservanti, sono un buon ambiente per la crescita microbica. Non è pratica comune per i produttori eseguire test di endotossina su queste soluzioni. La maggior parte esegue test microbiologici per determinare il livello microbiologico (Bio-burden) prima di sottoporre la soluzione a un processo di sterilizzazione. Tuttavia, per determinare il potenziale di alti livelli di endotossina, sarebbe consigliabile eseguire i test microbiologici prima di eseguire qualsiasi fase di sterilizzazione. Per esempio, se un prodotto viene formulato e filtrato prima di una sterilizzazione finale, il test microbiologico del Bio-burden dopo la filtrazione fornirà alcune informazioni utili per la determinazione dell’adeguatezza del processo di sterilizzazione. Tuttavia, fornirà poche, se non nessuna, informazioni relative all’adeguatezza del processo per quanto riguarda la minimizzazione della contaminazione da endotossine. Poiché le endotossine derivano da alti livelli di microrganismi e non vengono rimossi dalla sterilizzazione o dai filtri microbiologici, la successiva riduzione di un alto livello microbiologico non sarà associata a una simile riduzione di un alto livello di endotossine.

Come per i prodotti farmaceutici parenterali, i dispositivi sterili hanno occasionalmente dimostrato di essere contaminati da endotossine. Le fonti sono state l’acqua che in qualche modo è entrata nel processo di produzione. Per esempio, il lavaggio di componenti come i mezzi di filtraggio da utilizzare per la fabbricazione di filtri, o il lavaggio/risciacquo di tubi o altri dispositivi di plastica prima della successiva sterilizzazione sono potenziali fonti di endotossine.

Depyrogenation

È difficile rimuovere le endotossine dai prodotti una volta presenti. È molto meglio mantenere i prodotti finiti e i componenti relativamente privi di endotossine piuttosto che doverle rimuovere una volta presenti.

Le procedure di depigmentazione più comuni per i componenti fisici includono l’incenerimento e la rimozione tramite lavaggio, chiamata anche diluizione. La letteratura ha dimostrato che altre procedure, come la filtrazione, l’irradiazione e il trattamento con ossido di etilene hanno un effetto limitato nel ridurre i livelli di pirogeno/endotossina. Per i sistemi di acqua per iniezione, i due modi accettabili di produzione sono la distillazione e l’osmosi inversa.

La distillazione ha dimostrato di essere efficace e il metodo più affidabile nella rimozione dell’endotossina dai campioni di acqua contaminata. Sono stati identificati problemi isolati relativi a spruzzi nell’alambicco e conseguente contaminazione del distillato. Allo stesso modo, si sono verificati problemi isolati con i condensatori o gli scambiatori di calore. Fare riferimento a ITG NO. 34, datato 31/07/79, per un’ulteriore discussione sugli scambiatori di calore.

Come per la maggior parte dei processi e delle attrezzature, è buona pratica conoscere i limiti e/o le capacità delle attrezzature. Per esempio, gli alambicchi con alti livelli di endotossine nell’acqua di alimentazione hanno occasionalmente dimostrato di produrre WFI di qualità inaccettabile ( >.25 EU/ml). Ancora di più, quando l’IFM è prodotto da osmosi inversa (RO), il livello di endotossina dell’acqua di alimentazione dovrebbe essere noto. Poiché i filtri RO non sono assoluti, può essere necessario averli in serie per produrre WFI senza pirogeni. Qualunque sia il sistema utilizzato, una buona pratica dovrebbe includere la capacità di isolare e valutare ogni pezzo di attrezzatura in un sistema WFI. Fare riferimento a ITG No. 36, datato 21/10/80, per una discussione sull’osmosi inversa.

Per i componenti fisici, come tappi e tubi, il risciacquo o la diluizione con sistemi di acqua apirogena è il più comune. Alcuni produttori, come i produttori di LVP, stanno impiegando la diluizione per rimuovere l’endotossina dai contenitori di vetro che vengono poi sterilizzati con altri mezzi. Come per la convalida per la sterilità, la convalida per la riduzione dell’endotossina dovrebbe includere una conoscenza del carico di endotossina e un challenge di endotossina soddisfacente. Va sottolineato che a causa della mancanza di sensibilità del test pirogeno USP condotto sui conigli, i test di “sfida” dovrebbero essere condotti utilizzando il test del lisato di amebociti di Limulus. Anche se non esiste una guida in questo settore, ci si aspetterebbe che ci sia una riduzione di almeno 3 log al di sotto della sfida endotossina quando viene impiegato il processo di diluizione.

Storicamente, le fiale o i componenti in vetro sono stati resi apirogeni mediante sterilizzazione a calore secco ad alte temperature. Alcuni testi hanno raccomandato la depigmentazione della vetreria e delle attrezzature mediante riscaldamento ad una temperatura di 250 C per 45 minuti. È stato riportato che 650 C per 1 minuto o 180 C per 4 ore, allo stesso modo, distruggono i pirogeni. Gli studi di Tsuji et al, pubblicati nel 1978, hanno dimostrato che a temperature più basse (di 170 C), la distruzione termica segue un tasso di secondo ordine, e una riduzione di 3 log dei livelli di endotossine a temperature più basse potrebbe non essere pratica.

Ci sono altri metodi meno comuni impiegati per rimuovere le endotossine. Nella produzione di polveri sterili, la cristallizzazione o la purificazione è comunemente impiegata per rimuovere le endotossine. Alcuni produttori hanno occasionalmente fatto ricorso a metodi meno accettabili come il lavaggio o il risciacquo del cristallo o della polvere con un solvente per rimuovere le endotossine.

NOTA: L’uso della diluizione o del risciacquo è accettabile per un componente fisico come un tappo o una fiala che non sarà iniettato. Tuttavia, quando lo si utilizza per un componente chimico, ha un valore limitato. Ci può essere solo la garanzia che il livello di endotossina sulla superficie esterna della polvere sia ridotto e non in tutto il cristallo.

Altri metodi meno generalmente accettabili includono il trattamento con ossido di etilene e l’irradiazione. È stato dimostrato che si sono verificate riduzioni di circa l’80% nella pirogenicità dell’endotossina di E. coli nei dializzatori dopo l’esposizione all’ossido di etilene.

Per quanto riguarda le attrezzature di produzione e le linee di trasferimento, la depigmentazione per diluizione è stata solitamente il metodo di scelta. L’utilizzo di alcali forti o soluzioni ossidanti è stato occasionalmente impiegato per ridurre i pirogeni in questi sistemi di stoccaggio/consegna. Tuttavia, dovrebbe essere seguita dal risciacquo con acqua per iniezione. Residui nella soluzione di risciacquo inferiori a 1 parte per milione (ppm) possono essere raggiunti e sono stati accettati.

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