La Spagna guadagnò un punto d’appoggio nell’attuale Florida, considerando quell’area e le terre a nord come una logica estensione del loro impero caraibico. Nel 1513, Juan Ponce de León aveva rivendicato l’area intorno all’odierna St. Augustine per la corona spagnola, chiamando la terra Pascua Florida (Festa dei Fiori, o Pasqua) per la festa più vicina. Ponce de León non riuscì a stabilirvi un insediamento permanente, ma nel 1565 la Spagna aveva bisogno di un avamposto per affrontare i corsari francesi e inglesi che usavano la Florida come base da cui attaccare le navi spagnole cariche di tesori dirette da Cuba alla Spagna. La minaccia agli interessi spagnoli prese una nuova piega nel 1562 quando un gruppo di protestanti francesi (ugonotti) stabilì un piccolo insediamento che chiamarono Fort Caroline, a nord di St. Con l’autorizzazione del re Filippo II, il nobile spagnolo Pedro Menéndez guidò un attacco a Fort Caroline, uccidendo la maggior parte dei coloni e distruggendo il forte. Eliminare Fort Caroline servì agli spagnoli per un duplice scopo: aiutò a ridurre il pericolo dei corsari francesi e sradicò la minaccia francese alla rivendicazione della Spagna sull’area. La contesa per la Florida illustra come le rivalità europee si siano riversate nelle Americhe, in particolare il conflitto religioso tra cattolici e protestanti.
Nel 1565 il vittorioso Menéndez fondò Sant’Agostino, oggi il più antico insediamento europeo nelle Americhe. Nel processo, gli spagnoli spostarono gli indiani Timucua locali dalla loro antica città di Seloy, che esisteva da migliaia di anni. I Timucua hanno sofferto molto a causa delle malattie introdotte dagli spagnoli, passando da una popolazione di circa 200.000 persone prima del contatto a cinquantamila nel 1590. Nel 1700 rimasero solo mille Timucua. Come in altre aree di conquista spagnola, i sacerdoti cattolici lavorarono per realizzare una conquista spirituale, costringendo i Timucua sopravvissuti, demoralizzati e provati da perdite catastrofiche della famiglia e della comunità, a convertirsi al cattolicesimo.
La Florida spagnola era un obiettivo invitante per i rivali imperiali della Spagna, soprattutto gli inglesi, che volevano avere accesso ai Caraibi. Nel 1586, i coloni spagnoli di St. Augustine scoprirono la loro vulnerabilità agli attacchi quando il pirata inglese Sir Francis Drake distrusse la città con una flotta di venti navi e cento uomini. Nei decenni successivi, gli spagnoli costruirono altri forti di legno, che furono tutti bruciati dalle incursioni dei rivali europei. Tra il 1672 e il 1695, gli spagnoli costruirono un forte di pietra, il Castillo de San Marcos, per difendere meglio St. Augustine dagli sfidanti.
Il forte spagnolo del Castillo de San Marcos aiutò i coloni spagnoli di St. Augustine a respingere i predoni dei paesi europei rivali.