Anche se il modello classico è stato molto utile per comprendere il processo di differenziazione delle HSC, vale la pena notare che questo modello ha alcuni difetti in quanto semplifica eccessivamente la complessità delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), e si basa solo sui marcatori di superficie e sul trapianto utilizzando cellule bulk. L’analisi delle cellule bulk presuppone che ogni cellula, che ha lo stesso fenotipo, possieda una funzione identica. Con i progressi nella tecnologia delle cellule singole e nei modelli genetici di topo, questo modello classico è stato messo in discussione negli ultimi anni, specialmente nella spiegazione della megacariopatia. Inoltre, nuovi tipi di HSPC sono stati identificati ed estesamente studiati a causa dei loro bias di discendenza.
Eterogeneità nel lineage output delle HSCs e dibattiti sulla differenziazione dei megacariociti
Utilizzando l’analisi di diluizione limitante e il trapianto di singole cellule, i gruppi Sieburg e Eaves hanno definito le HSCs con bias di mieloide (My-Bi), bilanciate (Ba) e con bias di linfoide (Ly-Bi) in base al rapporto tra output di cellule mieloidi e linfoidi (Muller-Sieburg et al, 2002; Muller-Sieburg et al., 2004; Dykstra et al., 2007; Benz et al., 2012) (Fig. 2A e 2B). Inoltre, le HSC piastriniche sono state riportate anche come un sottoinsieme My-Bi che risiede in cima alla gerarchia ematopoietica (Sanjuan-Pla et al., 2013) (Fig. 2C). I ricercatori hanno da tempo riconosciuto il concetto di LT-HSCs e ST-HSCs. Sulla base del periodo di ricostituzione, le CSE a medio termine (CSE IT), che si trovano tra le CSE LT e le CSE ST e contribuiscono alla ricostituzione fino a 8 mesi dopo il trapianto, sono state utilizzate in diversi laboratori (Benveniste et al., 2010; Yamamoto et al., 2013). Inoltre, Lu et al. hanno tracciato singole HSC in vivo usando il barcoding genetico virale combinato con il sequenziamento ad alta velocità (Lu et al., 2011). Hanno anche rivelato l’eterogeneità nella popolazione HSC. In questo test, hanno dimostrato che le CSE non contribuiscono ugualmente alla progenie, e che due modelli distinti di differenziazione delle CSE coesistono nello stesso topo ricevente dopo l’irradiazione. Un modello di differenziazione consiste in popolazioni di cellule progenitrici tra cui GMP, MEP e CLP; l’altro gruppo consiste in cellule ematiche linfoidi mature. Allo stesso modo, con il trapianto di una singola cellula, Yamamoto et al. hanno osservato che i progenitori auto-rinnovanti con lignaggio limitato esistono in HSC fenotipicamente definite, contenenti progenitori ripopolanti megacariociti (MkRPs), progenitori ripopolanti megacariociti-eritrociti (MERPs), e progenitori ripopolanti mieloidi comuni (CMRPs) (Yamamoto et al., 2013) (Fig. 2D). Questo studio suggerisce che le cellule oligo-, bi- e unipotenti coesistono nelle popolazioni HSC. Inoltre, i marcatori della famiglia SLAM CD150 e CD229 possono segregare le HSC in diverse frazioni con capacità di ricostituzione differenziale. Rispetto alle HSC CD150med, le HSC CD150hi hanno mostrato un più alto potenziale di auto-rinnovamento con differenziazione di tipo mieloide (Morita et al., 2010). Le CD229- HSC hanno un potenziale di auto-rinnovamento a lungo termine con potenziale mieloide e formano tutte le altre popolazioni di cellule staminali e progenitrici, mentre le CD229+ HSC sembrano avere meno capacità di auto-rinnovamento con potenziale linfoide (Oguro et al., 2013). Le analisi omiche monocellulari (Moignard et al., 2013; Wilson et al., 2015; Nestorowa et al., 2016; Buenrostro et al, 2018; Laurenti e Gottgens, 2018; Jacobsen e Nerlov, 2019), tra cui il sequenziamento dell’RNA monocellulare (scRNA-seq) e il test della cromatina accessibile per trasposasi tramite sequenziamento (scATAC-seq), hanno ulteriormente scoperto la presenza di eterogeneità nelle popolazioni HSC più primitive.
(A) Modello delle CSE My-Bi e Ly-Bi. Le CSE Ly-Bi ricostituiscono il lignaggio mieloide in misura minore rispetto al lignaggio linfoide, e viceversa. (B) Il laboratorio di Eaves ha definito le cellule α, β, γ e δ in base alla percentuale di chimerismo mieloide rispetto a quello linfoide (rapporto M/L). Una singola cellula del donatore è definita come cellule α quando il rapporto M/L supera 2, cellule β quando il rapporto M/L supera 0,25 ma è inferiore a 2, e cellule γ/δ quando è inferiore a 0,25. Pertanto, le cellule α sono di tipo mieloide, le cellule β sono bilanciate e le cellule γ/δ sono di tipo linfoide senza capacità di 2° trapianto. (C) Le HSC vWF+ di tipo piastrinico si trovano all’apice della gerarchia e possono differenziarsi in tutti i progenitori e le cellule mature. Le HSC vWF- di tipo linfoide risiedono a valle delle HSC vWF+. Le LMPP non possono dare origine alla stirpe dei megacariociti/eritrociti. I MEP derivano direttamente dalle HSC. (D) Nel modello di bypass mieloide, la popolazione LT-HSC contiene CMRPs, MERPs, e MkRPs. Queste MyRP sono prodotte direttamente dalle CSE. (E) I sottotipi MPP sono separati in MPP1-4. MPP1 può dare origine a tutti i lignaggi. MPP2/3 sono di tipo mieloide e MPP4 è di tipo linfoide. Inoltre, MPP2 è di tipo piastrinico. (F) In questo modello, le MPP si differenziano in Pre MegE, Pre GM e CLP. Pre MegE è a monte di MkP e pre CFU-E. Pre GM dà origine a GMP, e successivamente genera precursori neutrofili appena definiti (Pre Neu)
L’origine dei megacariociti è stata oggetto di dibattito per diversi anni. Il gruppo di Jacobsen ha identificato i MPPs (LMPPs) a innesco linfoide che danno origine ai lignaggi di granulociti/macrofagi e linfoidi ma non al lignaggio di megacariociti/eritrociti (Adolfsson et al., 2005) (Fig. 2C). Tuttavia, gli studi di lineage tracing sfidano questa visione e suggeriscono che le LMPP si differenziano anche in un lineage megacariocita/eritrocito (Forsberg et al., 2006; Boyer et al., 2011). I diversi risultati possono essere attribuiti alla dose di cellule utilizzate per il trapianto e ai metodi, compresi i modelli di topo, utilizzati nei diversi laboratori. Più recentemente, l’espressione dell’mRNA del marcatore megacariocitario von Willebrand factor (vWF) e il recettore di superficie c-Kit sono stati suggeriti come indicativi di una sottopopolazione di CSE piastrinica, ma multipotente (Sanjuan-Pla et al., 2013; Shin et al., 2014). La prova di una popolazione di HSC basata sulle piastrine è stata fornita dal gruppo Jacobsen (Sanjuan-Pla et al., 2013). Hanno scoperto che il 25% delle LT-HSC esprime vWF e che le HSC vWF+ sono predisposte all’espressione genica specifica per le piastrine, con una maggiore propensione alla ricostituzione a lungo termine delle piastrine. Le HSC vWF+ primed piastriniche hanno anche una tendenza a lungo termine del lignaggio mieloide, possono autorinnovarsi e possono dare origine a HSC vWF-linfoidi (Fig. 2C). Pertanto, le CSE piastriniche siedono in cima alla gerarchia ematopoietica. Inoltre, sulla base di esperimenti di trapianto di singole cellule, l’esistenza di cellule di linea megacariociti limitato nel compartimento fenotipico HSC è stato proposto (Yamamoto et al., 2013). Il test di trapianto di cellule a coppie indica che i precursori dei megacariociti derivano direttamente dalle HSC (Yamamoto et al., 2013) (Fig. 2D). In seguito, uno studio ha riportato che il compartimento HSC contiene progenitori commessi megacariocitari di tipo staminale (SL-MkPs), una popolazione cellulare che condivide molte caratteristiche con le HSCs (Haas et al., 2015). Questa popolazione si attiva su stress infiammatorio per ricostituire efficientemente le piastrine, quindi è stata suggerita una potenziale scorciatoia dalle CSE ai megacariociti in condizioni infiammatorie (Haas et al., 2015). Inoltre, tracciando i progenitori e le cellule di lignaggio mature prodotte da singole HSC trapiantate, un recente rapporto del laboratorio di Jacobsen ha dimostrato che una classe distinta di HSC adotta un destino verso il rifornimento a lungo termine ed efficace di megacariociti/piastrine senza rifornimento di altre linee di cellule del sangue, mentre nessuna HSC contribuisce esclusivamente a qualsiasi altra singola linea di cellule del sangue (Carrelha et al, 2018).
Collettivamente, le CSE e i megacariociti condividono diverse caratteristiche, per esempio l’espressione del recettore della trombopoietina (MPL), CD150, CXCR4 e vWF, ecc (Wang et al., 1998; Sugiyama et al., 2006; Pronk et al., 2007; Yoshihara et al., 2007; Huang e Cantor, 2009). Ancora più importante, i megacariociti servono anche come componente della nicchia HSC e regolano strettamente il mantenimento della funzione HSC (Bruns et al., 2014; Zhao et al., 2014). Le HSC vWF+ basate su piastrine e mieloidi, ma non le HSC vWF- basate su linfoidi, si associano ai megacariociti e sono regolate dai megacariociti (Pinho et al., 2018). Tutte le prove suggeriscono che le HSC e il megacariocita (o i suoi progenitori) sono più vicini l’uno all’altro nella gerarchia di sviluppo ematopoietico di quanto precedentemente apprezzato. In considerazione dell’eterogeneità osservata nella popolazione HSC, la nostra opinione è che la predeterminazione del lignaggio (destino cellulare) avviene nelle HSC, prima della loro differenziazione verso i progenitori. Inoltre, il megacariocita può sorgere indipendentemente da altri lignaggi, e il percorso di differenziazione dei megacariociti è prima separato da altri lignaggi di cellule del sangue nella gerarchia.
Eterogeneità nelle MPP
I Trumpp (Wilson et al, 2008) e Passegue (Pietras et al., 2015) hanno ulteriormente suddiviso la popolazione MPP in MPP1, MPP2, MPP3 e MPP4 in base al loro immuno-fenotipo, stato del ciclo cellulare, bias di lignaggio, resistenza al trattamento farmacologico e abbondanza di midollo osseo. MPP1 è più simile alle IT-HSC o ST-HSC definite in precedenza, che hanno capacità di ricostituzione di più lignaggi fino a 4 mesi nel primo trapianto, mentre MPP2/3/4 sono privi di potenziale di autorinnovamento e mostrano solo capacità di ricostituzione mieloide a breve termine (<1 mese). Ancora più importante, MPP2 e MPP3 producono bassi livelli di cellule T e B e MPP4 genera bassi livelli di cellule mieloidi in vivo. Inoltre, rispetto a MPP3 e MPP4, MPP2 produce livelli più alti di piastrine. Nel complesso, MPP2 è un sottogruppo MPP basato sui megacariociti e MPP3 è un sottogruppo MPP basato sui mieloidi. Sia MPP2 che MPP3 sono funzionalmente distinti dal sottogruppo MPP4 di origine linfoide. HSCs indipendentemente generare tutti e tre i tipi di lineage-biased MPPs (MPP2-4), ma tra di loro, nessun MPPs sono in grado di generare altri MPPs in vivo (Fig. 2E). Dopo il trapianto, HSCs prima producono MPPs mieloide-biased (MPP1/2) per stabilire rapidamente uscita mieloide, seguita dalla subpopolazione MPP4 linfociti-primed per ricostruire il compartimento linfoide. Pertanto, le MPP sono una popolazione eterogenea con diversi potenziali basati sul lineage sia a livello cellulare che molecolare.
Eterogeneità e gerarchia all’interno dei progenitori mieloidi
Nel modello classico, le CMP e le MEP sono separate in base all’espressione del CD34. Nella popolazione Lin-cKit+Sca1- (LKS-), le CMP sono CD34+CD16/32-, mentre le MEP sono CD34-CD16/32-. Si pensa che le CMP possiedano un’oligopotenza, compreso il potenziale di differenziazione di granulociti, macrofagi, megacariociti ed eritrociti. Tuttavia, i CMP hanno una bassa frequenza clonale di colonie mieloidi miste, e i MEP possiedono anche un basso livello di potenziale megacariocitario (Nakorn et al., 2003). Pertanto, ci spinge a sapere se ogni CMP o MEP ha un potenziale di lineage diverso a livello di singola cellula, cioè, se ogni CMP è effettivamente oligopotente, e se la MEP è bipotente.
Per capire l’eterogeneità e l’impegno di linea nella popolazione di progenitori mieloidi LKS-, specialmente nei CMP, Pronk et al. (Pronk et al., 2007) hanno usato CD150, CD105 (Endoglin), CD41 e CD16/32 per risegregare i progenitori mieloidi LKS-. Nella popolazione LKS-, le cellule CD41+CD150+ sono definite come progenitori megacariocitari (MkPs), che sono esclusivamente associati alla generazione di megacariociti. Le cellule CD41-CD150- CD16/32+ sono GMP. Nella popolazione CD41-CD150-CD16/32- (miscela classica di CMPs e MEPs), ci sono quattro sottopopolazioni recentemente definite, tra cui pre MegEs, pre GMs, Pre CFU-Es e CFU-Es (Pronk et al., 2007). Singole cellule Pre MegE possono produrre efficacemente colonie di megacariociti, eritroidi e colonie miste megacariociti/eritroidi. Al contrario, le cellule Pre CFU-E danno origine quasi esclusivamente a colonie eritroidi di varie dimensioni. Le Pre GM si trovano a monte, dal punto di vista dello sviluppo, delle GMP e hanno un lineage clonale notevolmente simile a quello delle GMP. Pertanto, lo studio di Pronk et al. esplora i processi di differenziazione delle cellule mieloidi, rivela una serie di nuovi progenitori intermedi e orchestra un nuovo modello di gerarchia, compresi i precursori neutrofili unipotenti proliferativi (Kim et al., 2017; Evrard et al., 2018; Zhu et al., 2018). I CMP classici consistono in pre GMs, e la maggior parte dei pre MegEs e MEPs sono separati in CFU-E, Pre CFU-Es, e parte dei pre MegEs. Inoltre, MkPs si trovano principalmente in CMPs (Pronk et al., 2007) (Fig. 2F).
In linea con il lavoro discusso sopra, un documento di riferimento dal laboratorio di Amit riportando i trascrittomi per più di 2.600 topo singolo LKS- cellule progenitrici mielo-eritroidi (Paul et al, 2015) e un lavoro successivo dal laboratorio di Gottgens che riporta i trascrittomi di 1.600 HSPCs (Nestorowa et al., 2016) entrambi hanno rivelato eterogeneità nei progenitori LKS-. Le singole cellule delle classiche MEP non mostrano alcuna espressione di marcatori megacariocitari o di TF megacariocitari prominenti. Tuttavia, sia i marcatori megacariocitari (Pf4 e CD41) che i TF (Pbx1, Fli1, Mef2c) sono espressi nelle cellule delle classiche CMP (Paul et al., 2015).
Tutti gli studi hanno spiegato perché i megacariociti si differenziano principalmente dalle CMP, ma non dalle MEP, e le MEP danno origine principalmente agli eritrociti. Pertanto, questo suggerisce che le classiche MEP potrebbero non essere il vero precursore dei megacariociti.
La differenziazione ematopoietica è un processo continuo
Studi precedenti hanno indicato che le singole CSE acquisiscono gradualmente bias di lignaggio lungo molteplici direzioni mentre passano attraverso discrete popolazioni di progenitori gerarchicamente organizzati (Fig. 3A). Tuttavia, questi modelli sono basati sull’analisi di popolazioni di cellule predefinite e ordinate in base al flusso. Con i progressi nelle metodologie, è diventato possibile studiare le somiglianze o le differenze delle singole HSPC e le loro relazioni di differenziazione.
(A) Il modello di differenziazione discreta mostra che le CSE si differenziano in cellule di lignaggio mature la progressione è un processo graduale seguendo una gerarchia ad albero di progenitori oligo-, bi- e unipotenti. (B) Il modello di differenziazione continua mostra che non c’è un confine ovvio nella gerarchia. Le singole CSE acquisiscono gradualmente bias di lignaggio lungo molteplici direzioni senza passare attraverso popolazioni discrete di progenitori organizzati gerarchicamente
Utilizzando scRNA-seq combinato con analisi computazionale, un recente studio sulle HSPC del midollo osseo umano campionate in modo completo ha suggerito un modello in cui l’acquisizione dei destini specifici del lignaggio è un processo continuo, e le cellule limitate al lignaggio emergono direttamente da un continuum di HSPC indifferenziate a basso primed, senza alcuna transizione importante attraverso le fasi multi e bi-potenti (Velten et al., 2017). Questo punto di vista è supportato da uno studio su zebrafish che ha suggerito che il continuum della differenziazione delle HSPC è caratterizzato da un programma trascrizionale altamente coordinato, che mostra la soppressione simultanea dei geni legati alla proliferazione cellulare e l’upregolazione dei geni specifici del lineage (Macaulay et al., 2016). Inoltre, un altro studio utilizzando cellule progenitrici linfo-mieloidi del sangue del cordone ombelicale umano, tra cui LMPPs, GMPs e progenitori multi-linfoidi (MLPs), ha ulteriormente suggerito un modello in cui un continuum di progenitori esegue la differenziazione linfoide e mieloide, piuttosto che solo progenitori unilineari presenti a valle delle cellule staminali (Karamitros et al., 2018). Sebbene la maggior parte dei progenitori abbia un potenziale uni-lineage, progenitori bi- e oligo-lineage sono presenti tra le LMPP, le GMP e le MLP. Questi studi sopra citati cambiano la nostra visione che la differenziazione ematopoietica è un processo continuo, piuttosto che una gerarchia discreta, il che suggerisce che non c’è un confine ovvio tra cellule staminali e progenitori (Laurenti e Gottgens, 2018) (Fig. 3B).
La roadmap dell’ematopoiesi umana
Nell’ematopoiesi umana, il gruppo Dick ha smistato le MPP, le CMP e le MEP dal fegato fetale e dal midollo osseo adulto, e ha confrontato il loro potenziale di lineage da diverse fasi di sviluppo (Notta et al, 2016). Hanno dimostrato che le MPP, le CMP e le MEP precedentemente definite sono eterogenee. È importante notare che le MEP, sia dal fegato fetale che dal midollo osseo, producono uniformemente cloni solo eritroidi. Pertanto, le MEP classicamente definite sono principalmente precursori eritroidi quando analizzati a risoluzione singola cella e non sono megacariociti / progenitori eritroidi come precedentemente pensato, che è coerente con l’osservazione in un modello di topo (Pronk et al., 2007). È interessante notare che il fegato fetale contiene un gran numero di progenitori oligopotenti distinti. Tuttavia, pochi progenitori oligopotenti erano presenti nel midollo osseo adulto. Invece predominano solo due classi di progenitori, multipotenti e unipotenti, con linee di megacariociti/eritroidi che emergono da cellule multipotenti. Lo studio del gruppo di Dick fornisce un modello rivisto per comprendere l’ematopoiesi normale, che è effettivamente flessibile nel tempo di sviluppo.