54.9.5 Structure-Activity Aspects of the Cbl Transporters
Intrinsic factor bindt B12 met een dissociatieconstante van meer dan 1012 mol/L.361 In vergelijking met haptocorrine is intrinsic factor uniek in twee aspecten. Het bindt B12 maar niet het brede spectrum van corrinoïden dat door haptocorrine wordt herkend, en in tegenstelling tot haptocorrine wordt het niet verteerd door de enzymen die aanwezig zijn in het bovenste gedeelte van het maagdarmkanaal. Deze kenmerken zorgen ervoor dat alleen B12-vormen die door intrinsieke factor worden herkend, voor absorptie worden aangeboden in het terminale ileum. Intrinsieke factor is een eiwit met één aminozuurketen van ~ 50 kDa (417 aminozuren). Het eiwit kan uiteenvallen in twee delen: een N-terminaal fragment van 30 kDa en een C-terminaal fragment van 20 kDa. Interessant is dat elk van deze twee delen B12 herkent, maar als ze samen in oplossing zijn binden de gezamenlijke partners slechts één molecuul B12.338 Deze bevindingen komen overeen met de driedimensionale structuur van de intrinsieke factor die laat zien dat B12 ingeklemd zit tussen de N-terminale α-subeenheid en de C-terminale β-subeenheid327,335 (Fig. 54.15). De driedimensionale structuur biedt ook een verklaring voor de bevinding dat een 20-50 aminozuren C-terminaal afgeknotte intrinsieke factor niet langer een hoge affiniteit van B12 laat zien.362 Het C-terminale deel van het molecuul bevat alle waterstofbruggen en de meeste hydrofobe bindingen die betrokken zijn bij de herkenning van B12 door de β-subeenheid van het molecuul.
Het is al lang algemeen bekend dat intrinsieke factor B12 vormen met verschillende bovenste liganden op een vergelijkbare manier herkent (bijv, Met-B12 in vergelijking met CN-B12) en in overeenstemming met deze kennis toont de voorspelde kristalstructuur dat het bovenste ligand is blootgesteld aan het oplosmiddel.305,327 De specificiteit voor B12 waarmee de intrinsieke factor in vergelijking met haptocorrine wordt geconfronteerd, kan worden verklaard door de aanwezigheid van volumineuze aminozuren zoals tryptofaan en tyrosine in de B12-bindingszak van haptocorrine, maar niet van de intrinsieke factor.327
Er zijn ongeveer 10 patiënten beschreven met mutaties in het GIF-gen dat codeert voor de intrinsieke factor, maar dergelijke mutaties hebben niet bijgedragen aan ons begrip van de structuur-functie relaties voor binding van B12 aan de intrinsieke factor, aangezien de meeste van hen verklaard worden door twee specifieke nonsense mutaties.323,363 Momenteel is het niet duidelijk of een uitwisseling van aminozuur nummer vijf van een glutaminezuur naar arginine verband houdt met een verminderde functie van intrinsieke factor.327,364
Intrinsieke factor is een glycoproteïne, en de koolhydraatstructuur wordt verondersteld belangrijk te zijn voor zijn stabiliteit ten opzichte van enzymatische degradatie, hoewel dit onvoldoende is onderzocht, deels omdat de koolhydraatstructuur van menselijke intrinsieke factor nog moet worden opgehelderd. Met intrinsieke factor van ratten is aangetoond dat het koolhydraatgedeelte niet van belang is voor de herkenning van B12 of voor de binding van de intrinsieke factor aan zijn receptor.365
De structuur van de cubam-receptor is tamelijk uniek. Cubiline herkent de intrinsieke factor, terwijl amnionloos zorgt voor membraanverankering en endocytische capaciteit via twee fenylalanine-any-asparagine-proline-any-phenylalanine (FXNPXF) aminozuursequentiesignalen binnen het cytosolische domein. De twee signalen bevorderen de internalisering van het gehele complex via binding aan de clathrin-geassocieerde sorteereiwitten disabled-2 (Dab2) en autosomaal recessieve hypercholesterolemie (ARH).366 Het amnionloze deel van cubam werd geïdentificeerd op basis van een linkage equilibrium analyse van patiënten met het syndroom van Imerslund-Gräsbeck die geen mutaties in het cubilin gen hadden, en later zijn verschillende mutaties in amnionloos in verband gebracht met deze ziekte met clusters in Noorwegen en in de mediterrane gebieden.325,344 Uitgebreide studies in muizen en in een hondenmodel met spontane mutaties in het amnionless gen hebben aangetoond dat het eiwit niet alleen essentieel is voor de internalisatie van cubiline-gebonden liganden, maar ook voor het escorteren van cubiline naar het oppervlak van de cellen.316,367 Dit resultaat impliceert dat er geen cubam tot expressie komt op het celoppervlak als amnionless is aangetast en, als gevolg daarvan, de absorptie van B12 wordt gecompromitteerd.368
Het deel van cubam dat de intrinsieke factor B12 herkent, is cubilin. Het complex is gekristalliseerd (Fig. 54.15).342 De β- en α-subeenheden van de intrinsieke factor nemen deel aan de calcium-afhankelijke binding die ook de aanwezigheid van B12 vereist, zoals eerder voorspeld door studies over binding van de twee intrinsieke factor-subeenheden aan cubilin.339 Het N-terminale deel van cubilin met inbegrip van de CUB domeinen 5-8 is verantwoordelijk voor de herkenning van de intrinsieke factor en de kristalstructuur geeft aan dat de bindende domeinen CUB 6 en CUB 8342,369 zijn. Het belang van CUB 5-8 is gebaseerd op de waarneming dat de cubilin mutatie waarbij proline op positie 1297 door leucine wordt vervangen de binding tussen cubilin en de intrinsieke factor in gevaar brengt.370 Deze specifieke mutatie is waargenomen bij Finse patiënten die lijden aan het syndroom van Imerslund-Gräsbeck, hoewel een aantal andere mutaties in cubiline ook in verband zijn gebracht met de ziekte.325
Hoewel de structuur-functie relatie voor binding van intrinsieke factor aan cubiline goed is gedocumenteerd, is veel minder bekend over de specificiteit voor binding van andere eiwitten aan cubiline. In de nier neemt de cubilinereceptor deel aan de proximale reabsorptie van een verscheidenheid van eiwitten, waaronder het vitamine D-bindende eiwit (Gc), transferrine en albumine (voor bespreking zie Ref. 326). Bijgevolg vertonen vele patiënten met het syndroom van Imerslund-Gräsbeck een verhoogde uitscheiding van sommige van deze proteïnen in de urine. Studies die de relatie verduidelijken tussen specifieke veranderingen in cubiline en de eiwitten die in de urine voorkomen, kunnen aanvullende structuur-functie relaties aan het licht brengen.