Dans ce dessin de l’artiste français Jacques le Moyne de Morgues, les Timucua fuient les colons espagnols, qui arrivent par bateau. Le Moyne a vécu à Fort Caroline, l’avant-poste français, avant que les Espagnols ne détruisent la colonie en 1562.
L’Espagne a pris pied dans l’actuelle Floride, considérant cette région et les terres au nord comme une extension logique de leur empire des Caraïbes. En 1513, Juan Ponce de León avait revendiqué la région autour de l’actuelle Saint-Augustin pour la couronne espagnole, nommant la terre Pascua Florida (fête des fleurs, ou Pâques) pour la fête la plus proche. Ponce de León n’a pas réussi à y établir une colonie permanente, mais en 1565, l’Espagne avait besoin d’un avant-poste pour faire face aux corsaires français et anglais qui utilisaient la Floride comme base pour attaquer les navires espagnols chargés de trésors qui se rendaient de Cuba en Espagne. La menace pour les intérêts espagnols prend un nouveau tournant en 1562 lorsqu’un groupe de protestants français (huguenots) établit une petite colonie qu’ils appellent Fort Caroline, au nord de Saint-Augustin. Avec l’autorisation du roi Philippe II, le noble espagnol Pedro Menéndez a mené une attaque contre Fort Caroline, tuant la plupart des colons et détruisant le fort. L’élimination de Fort Caroline avait un double objectif pour les Espagnols : elle permettait de réduire le danger que représentaient les corsaires français et d’éradiquer la menace française sur les revendications de l’Espagne dans la région. La lutte pour la Floride illustre la façon dont les rivalités européennes ont débordé sur les Amériques, en particulier les conflits religieux entre catholiques et protestants.
En 1565, Menéndez, victorieux, a fondé Saint-Augustin, aujourd’hui la plus ancienne colonie européenne des Amériques. Dans le processus, les Espagnols ont déplacé les Indiens Timucua locaux de leur ancienne ville de Seloy, qui se tenait depuis des milliers d’années. Les Timucua ont beaucoup souffert des maladies introduites par les Espagnols, passant d’une population d’environ 200 000 personnes avant le contact à 50 000 en 1590. En 1700, il ne restait plus qu’un millier de Timucua. Comme dans d’autres régions de la conquête espagnole, les prêtres catholiques ont travaillé à la réalisation d’une conquête spirituelle en forçant les Timucua survivants, démoralisés et ébranlés par les pertes catastrophiques de leur famille et de leur communauté, à se convertir au catholicisme.
La Floride espagnole constituait une cible attrayante pour les rivaux impériaux de l’Espagne, notamment les Anglais, qui souhaitaient avoir accès aux Caraïbes. En 1586, les colons espagnols de St. Augustine ont découvert leur vulnérabilité aux attaques lorsque le pirate anglais Sir Francis Drake a détruit la ville avec une flotte de vingt navires et cent hommes. Au cours des décennies suivantes, les Espagnols ont construit d’autres forts en bois, qui ont tous été brûlés par des pirates européens. Entre 1672 et 1695, les Espagnols construisent un fort en pierre, le Castillo de San Marcos, pour mieux défendre St Augustine contre les challengers.
Le fort espagnol du Castillo de San Marcos a aidé les colons espagnols de St. Augustine à repousser les corsaires en maraude des pays européens rivaux.