Différenciation rapide de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline et de Staphylococcus aureus sensible à la méthicilline à partir de cultures sanguines en utilisant un test de diffusion directe sur disque à la céfoxitine

L’incidence des infections sanguines à Staphylococcus aureus acquises dans les soins de santé et dans la communauté a considérablement augmenté au cours des dernières décennies (20). Le rapport du National Nosocomial Infections Surveillance System de janvier 1992 à juin 2001 indique que plus de 55 % des isolats de S. aureus étaient résistants à la méthicilline, à l’oxacilline ou à la nafcilline (16). Les facteurs de risque associés à la bactériémie à S. aureus résistant à la méthicilline (SARM) sont les suivants : résidence dans un établissement de soins prolongés, exposition antérieure aux antibiotiques, diabète insulino-dépendant, hospitalisation prolongée, cathétérisme urinaire, pose de sonde nasogastrique, chirurgie antérieure et présence d’une maladie sous-jacente (13, 18, 19). La population âgée (≥65 ans) présente un risque significativement plus élevé de décès dû à une bactériémie à SARM que les populations plus jeunes (18, 22).

L’infection à SARM expose le patient à un risque accru d’autres problèmes de santé. La bactériémie à SARM a été associée à un risque accru d’insuffisance rénale aiguë, à des séjours plus longs à l’hôpital et en unité de soins intensifs, au développement d’une dépendance au ventilateur et à une augmentation des coûts hospitaliers (1, 6, 15). Plusieurs études ont montré que les patients atteints d’infections sanguines à SARM présentent un risque de mortalité nettement plus élevé que les patients atteints d’infections sanguines à S. aureus sensible à la méthicilline (MSSA) (1, 5, 19). Les taux de mortalité des patients qui développent une bactériémie à SARM sont estimés entre 23 % et 54 % (1, 8).

Il a également été démontré que les patients atteints de bactériémie à SARM présentent un risque accru de retard de traitement (15). Des choix d’antibiotiques inappropriés pour les patients atteints de bactériémie à S. aureus ont également été associés à des taux de mortalité hospitalière plus élevés (10). Les thérapies inappropriées consistaient en β-lactamines pour la bactériémie à SARM et en vancomycine pour la bactériémie à SARM. Le choix initial de la vancomycine pour la bactériémie à MSSA a été associé à une incidence plus élevée de clairance tardive de l’infection, et un traitement approprié tardif pour les patients atteints de SARM est un facteur prédictif indépendant de mortalité (10, 15).

Le choix de la thérapie pour les infections sanguines est devenu critique avec l’augmentation de la résistance aux antibiotiques observée avec de nombreux organismes. L’augmentation des organismes à Gram positif résistants à la vancomycine menace de nombreux régimes de traitement acceptés et justifie l’utilisation empirique des glycopeptides pour les infections sanguines (12). Ainsi, la caractérisation plus rapide des isolats de S. aureus provenant d’hémocultures comme étant résistants ou sensibles à l’oxacilline est un facteur important pour le traitement rapide et précis des patients bactériémiques.

Les échantillons d’hémoculture ont été recueillis dans des flacons aérobies et anaérobies (flacons BacT/Alert FA et BacT/Alert FN ; bioMérieux, Durham, NC) et dosés dans le BacT/Alert 3D (bioMérieux, Durham, NC). Les échantillons d’hémocultures qui présentaient des « cocci gram-positifs en amas » sur les colorations de Gram ont été trempés sur un écouvillon provenant d’une aliquote dérivée du flacon de sang en utilisant la même technique que celle utilisée pour la préparation d’un antibiogramme par diffusion sur disque (3). L’écouvillon a ensuite été utilisé pour strier toute la surface d’une plaque de 100 mm de gélose trypticase soja (BD BBL, Franklin Lakes, NJ), comme on le ferait pour un test de diffusion sur disque. Ensuite, un disque de céfoxitine (BBL Sensi-Disc, Franklin Lakes, NJ) a été placé au centre de la plaque, et les plaques ont été incubées pendant la nuit (10 à 24 h) entre 35 et 37°C à l’air ambiant. Le lendemain matin, la taille des zones de céfoxitine a été mesurée et enregistrée. Les résultats de la taille de la zone de céfoxitine mesurée ont été comparés aux résultats obtenus avec les tests de confirmation. Les tests de confirmation ont consisté à tester la sensibilité de l’organisme isolé à l’oxacilline à l’aide de la carte de sensibilité Vitek 2 GP-63 (bioMéreiux, Durham, NC) et du test standardisé de diffusion sur disque de la céfoxitine (3, 4). Les organismes ont été identifiés comme étant S. aureus par un test de coagulase en tube de 4 heures effectué directement à partir du bouillon de l’hémoculture ; les identifications ont été signalées le jour même où l’hémoculture a été jugée positive. Si la coagulase directe en tube était négative, un test de coagulase sur lame et/ou en tube était réalisé sur les colonies isolées le matin suivant lors de la lecture de la taille des zones de céfoxitine.

Au total, 782 échantillons d’hémoculture ont été testés, dont 276 ont donné lieu à une culture pure de S. aureus (provenant de 103 patients). Un total de 489 échantillons ont cultivé des staphylocoques à coagulase négative (SNC), 12 ont cultivé des espèces de Micrococcus, 4 ont cultivé à la fois S. aureus et SNC, et 1 a cultivé des espèces de Micrococcus et SNC. Parmi les 276 cultures pures de S. aureus, 105 (38,1 %) avaient des tailles de zone de céfoxitine directe qui mesuraient ≤17 mm, 18 (6,5 %) avaient celles qui mesuraient 18 mm, 8 (2,9 %) avaient celles qui mesuraient 19 mm, 8 (2,9 %) avaient celles qui mesuraient 20 mm et 137 (49,6 %) avaient celles qui mesuraient ≥21 mm (figure 1). Tous les échantillons dont la taille des zones mesurait ≤17 mm avec le test direct sur disque de céfoxitine ont été confirmés comme résistants à l’oxacilline par les deux méthodes de confirmation, et tous les échantillons dont la taille des zones mesurait ≥21 mm avec le test direct sur disque de céfoxitine ont été confirmés comme sensibles à l’oxacilline par les deux méthodes de confirmation. Ainsi, la détection de SARM ou de MSSA dans les hémocultures pouvait être signalée 10 à 24 h plus tôt pour 88 % des cultures avec une précision totale.

Trente-quatre échantillons dont la taille de la zone mesurait entre 18 et 20 mm contenaient une combinaison d’isolats de SARM et de MSSA. Sur ces 34 échantillons, 29 (85,3 %) ont été confirmés comme étant du SARM, et 5 (14,7 %) comme étant du MSSA. Cette plage de taille de zone a ensuite été qualifiée d' » indéterminée « , car les résultats de l’oxacilline pour les organismes entrant dans cette plage n’ont pas pu être déterminés par un test direct sur disque de céfoxitine avec une précision de 100 %, mais doivent attendre la réalisation d’un test de confirmation. On pourrait même envisager de qualifier de SARM présumé tous les organismes dont le diamètre de la zone est compris entre 18 et 20 mm, car plus de 85 % de ces échantillons se sont révélés être des SARM lors des tests de confirmation. Ces plages de zones (SARM, ≤20 mm ; MSSA, ≥21 mm) rendraient la précision du test direct sur disque à la céfoxitine >96 %.

Les temps d’incubation ont été évalués pour tous les isolats de l’étude dont les diamètres de zone étaient compris entre 18 et 20 mm afin de déterminer si les échantillons ayant des temps d’incubation plus courts étaient susceptibles d’entraîner des tailles de zone indéterminées. Sur les 34 échantillons qui se situaient dans la plage des zones indéterminées, 3 (9 %) avaient une durée d’incubation de 10 à 15 heures, 9 (26 %) avaient une durée d’incubation comprise entre 15 et 20 heures, et 22 (65 %) avaient une durée d’incubation de 20 à 24 heures. Il n’y avait pas de corrélation entre les durées d’incubation et les diamètres des zones indéterminées ; une majorité des échantillons indéterminés avaient des incubations complètes comprises entre 20 et 24 h, avec <10 % ayant <15 h d’incubation.

En évaluant les échantillons par patient, 39 des 103 patients avaient un SARM, et 64 un MSSA. En utilisant la première hémoculture positive pour chaque patient, 8 des 39 patients atteints de SARM avaient des résultats indéterminés (diamètres de zone compris entre 18 et 20 mm), tout comme 2 des 64 patients atteints de MSSA. Ainsi, en évaluant la première hémoculture positive du patient avec le test direct du disque de céfoxitine pour déterminer le résultat de l’oxacilline, 93 des 103 (>90 %) organismes des patients auraient été appelés avec une précision de 100 % en utilisant les paramètres de diamètres de zone ≤17 mm pour le SARM et de diamètres de zone ≥21 mm pour le MSSA, ce qui est très proche des 88 % observés lors du test de chaque hémoculture. Bien que nous n’ayons pas observé d’infections mixtes de SARM et de MSSA (l’un suivi de l’autre dans des prélèvements d’hémocultures ultérieurs), nous recommandons de tester tous les  » cocci gram-positifs en grappes  » des hémocultures avec le test direct du disque de céfoxitine, car ce scénario pourrait se produire.

La nécessité de différencier le SARM du MSSA à partir d’échantillons d’hémocultures en temps opportun est importante pour fournir les meilleurs soins aux patients en utilisant des antibiotiques appropriés dès que possible. Plusieurs mécanismes permettent de déterminer les espèces de Staphylococcus et/ou les résultats de l’oxacilline directement à partir des flacons d’hémoculture, notamment la gélose chromogène de différenciation sélective (17), les méthodes d’identification directe telles que le test BBL Crystal MRSA ID (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD) (11), et les méthodes moléculaires, notamment le test BD GeneOhm StaphSR (Becton Dickinson, Sparks, MD), le test d’hémoculture Xpert MRSA/SA de Cepheid (Sunnyvale, CA), la détection multiplex du mecA et des gènes nuc (12), détection des gènes mecA et orfX par PCR en temps réel (21), et le test IDI en temps réel (Infectio Diagnostic, Sainte-Foy, Québec, Canada) utilisant le SmartCycler (Cepheid, Sunnyvale, CA) (7). En outre, le test d’agglutination au latex du SARM PBP2a (Oxoid Ltd., Basingstoke, Royaume-Uni) pourrait être utilisé le matin suivant la sous-culture d’échantillons positifs si la croissance est suffisante (en fonction du temps d’incubation). Cela donnerait un délai d’exécution similaire à celui de notre protocole ; cependant, le test au latex PBP2a nécessite des colonies bien isolées, fonctionne plus efficacement lorsqu’il est groupé, prend du temps supplémentaire de la part du personnel pour les tests et est plus coûteux.

Toutes les techniques mentionnées ci-dessus utilisent des ressources de laboratoire supplémentaires, telles que des systèmes d’identification des kits et/ou des milieux spécialisés ou des tests moléculaires. Bien qu’ils soient rapides et précis, ces tests sont souvent mieux utilisés pour les tests par lots, sont tous plus coûteux et nécessitent plus de travail pour le laboratoire et, dans le cas des tests moléculaires, peuvent souvent nécessiter une expertise et des instruments moléculaires supplémentaires qui peuvent ne pas être facilement disponibles. Cette étude présente une approche permettant de déterminer le résultat à l’oxacilline des isolats de S. aureus directement à partir d’échantillons d’hémoculture. Cette approche peut être utilisée de manière rentable et précise et ne doit pas être testée par lots, mais peut être lue rapidement et individuellement à chaque poste de travail. Il est compréhensible que le laboratoire doive tester toutes les hémocultures présentant des cocci gram-positifs en grappes, mais comme le matériel et l’expertise nécessaires pour effectuer le test direct sur disque de céfoxitine font déjà partie du laboratoire de microbiologie diagnostique de routine, le coût supplémentaire d’une plaque de gélose trypticase soja et d’un disque de céfoxitine vaut bien la dépense modeste (∼$0,50/SA culture) afin de signaler plus rapidement la présence de MSSA ou de MRSA à partir des hémocultures. Pour les résultats directs du disque de céfoxitine de taille de zone ≤17-mm ou ≥21-mm, la précision de la déclaration des résultats de l’oxacilline pour les isolats de S. aureus était de 100%. En utilisant ce protocole, le laboratoire peut donner un résultat précis pour l’oxacilline jusqu’à 24 h plus rapidement qu’en attendant que les antibiogrammes de routine soient terminés. Il convient de noter que ces points de rupture ont été déterminés par les résultats de cette étude et ne coïncident pas exactement avec ceux publiés par le CLSI pour l’évaluation de la résistance à l’oxacilline en utilisant des disques de céfoxitine provenant de colonies isolées de staphylocoques (4). En outre, comme cette étude n’était pas basée sur les directives du CLSI, la gélose au sang a été choisie pour être utilisée plutôt que la gélose Mueller-Hinton classique utilisée dans les protocoles de test standardisés, car la gélose au sang était moins chère (d’environ 40 % dans notre institution) et serait plus facilement disponible pour les laboratoires qui utilisent principalement des instruments automatisés pour les tests de sensibilité.

En rapportant plus rapidement les résultats de l’oxacilline pour les isolats de S. aureus provenant de cas de bactériémie, les patients pourraient être traités plus tôt avec l’antibiotique le plus efficace. Le traitement approprié et rapide d’un patient avec l’antibiotique le plus efficace réduira les complications pour le patient, la durée de son séjour à l’hôpital et la morbidité et la mortalité du patient, ce qui se traduira par des économies accrues pour les institutions médicales (10, 14, 15, 18). En outre, l’utilisation plus appropriée de la vancomycine diminuera l’émergence de la résistance à ce médicament dans les organismes gram-positifs (2, 9).

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