Aunque el modelo clásico ha sido muy útil para comprender el proceso de diferenciación de las HSC, cabe señalar que este modelo tiene algunas deficiencias en el sentido de que simplifica en exceso la complejidad de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), y sólo se basa en los marcadores de superficie y en el trasplante mediante células a granel. El análisis de las células a granel asume que cada célula, que tiene el mismo fenotipo, posee una función idéntica. Con los avances en la tecnología de células individuales y los modelos genéticos de ratón, este modelo clásico se ha puesto en tela de juicio en los últimos años, especialmente en la elucidación de la megacariopoyesis. Además, se han identificado nuevos tipos de HSPCs y se han estudiado ampliamente debido a sus sesgos de linaje.
Heterogeneidad en la salida del linaje de las HSCs y debates sobre la diferenciación de los megacariocitos
Utilizando el análisis de dilución limitante y el trasplante de una sola célula, los grupos de Sieburg y Eaves definieron las HSCs con sesgo mieloide (My-Bi), equilibradas (Ba) y con sesgo linfoide (Ly-Bi) basándose en la proporción de salidas de células mieloides y linfoides (Muller-Sieburg et al, 2002; Muller-Sieburg et al., 2004; Dykstra et al., 2007; Benz et al., 2012) (Fig. 2A y 2B). Además, también se ha informado de que las CMH con predisposición a las plaquetas son un subconjunto My-Bi que reside en la parte superior de la jerarquía hematopoyética (Sanjuan-Pla et al., 2013) (Fig. 2C). Los investigadores han reconocido desde hace tiempo el concepto de LT-HSCs y ST-HSCs. Basándose en el periodo de reconstitución, en varios laboratorios se han utilizado las HSC intermedias (IT-HSC), que se sitúan entre las LT-HSC y las ST-HSC y contribuyen a la reconstitución hasta 8 meses después del trasplante (Benveniste et al., 2010; Yamamoto et al., 2013). Además, Lu et al. realizaron un seguimiento de las HSC individuales in vivo utilizando un código de barras genético viral combinado con una secuenciación de alto rendimiento (Lu et al., 2011). También revelaron la heterogeneidad de la población de HSC. En este ensayo, demostraron que las HSC no contribuyen por igual a la progenie, y que coexisten dos patrones de diferenciación de HSC distintos en el mismo ratón receptor tras la irradiación. Un patrón de diferenciación consiste en poblaciones de células progenitoras que incluyen GMPs, MEPs y CLPs; el otro grupo consiste en células sanguíneas linfoides maduras. De forma similar, con el trasplante de una sola célula, Yamamoto et al. observaron que existen progenitores autorrenovables de linaje restringido en las CEH definidas fenotípicamente, que contienen progenitores repobladores de megacariocitos (MkRP), progenitores repobladores de megacariocitos-eritrocitos (MERP) y progenitores repobladores mieloides comunes (CMRP) (Yamamoto et al., 2013) (Fig. 2D). Este estudio sugiere que las células oligo, bi y unipotentes coexisten en las poblaciones de HSC. Además, los marcadores de la familia SLAM CD150 y CD229 pueden segregar las HSC en diferentes fracciones con capacidad de reconstitución de la diferenciación. En comparación con las HSC CD150med, las HSC CD150hi mostraron un mayor potencial de autorrenovación con diferenciación de tipo mieloide (Morita et al., 2010). Las HSC CD229- tienen un potencial de autorrenovación a largo plazo con un potencial de sesgo mieloide y forman todas las demás poblaciones de células madre y progenitoras, mientras que las HSC CD229+ parecen tener una menor capacidad de autorrenovación con un potencial de sesgo linfoide (Oguro et al., 2013). Los análisis ómicos unicelulares (Moignard et al., 2013; Wilson et al., 2015; Nestorowa et al., 2016; Buenrostro et al, 2018; Laurenti y Gottgens, 2018; Jacobsen y Nerlov, 2019), incluyendo la secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) y el ensayo unicelular de cromatina accesible por transposasa mediante secuenciación (scATAC-seq), han descubierto aún más la presencia de heterogeneidad en las poblaciones de HSC más primitivas.
(A) Modelo de HSCs My-Bi y Ly-Bi. Las HSCs Ly-Bi reconstituyen el linaje mieloide en menor medida que el linaje linfoide, y viceversa. (B) El laboratorio de Eaves definió las células α, β, γ y δ según el porcentaje de quimerismo mieloide en relación con el quimerismo linfoide (relación M/L). Una célula del donante se define como células α cuando la relación M/L es superior a 2, células β cuando la relación M/L es superior a 0,25 pero inferior a 2, y células γ/δ cuando es inferior a 0,25. Por lo tanto, las células α tienen una predisposición mieloide, las células β están equilibradas y las células γ/δ tienen una predisposición linfoide sin capacidad de segundo trasplante. (C) Las CMH con predisposición plaquetaria vWF+ se sitúan en el vértice de la jerarquía y pueden diferenciarse en todos los progenitores y células maduras. Las CMH con predisposición linfoide vWF- residen en la parte inferior de las CMH vWF+. Las LMPP no pueden dar lugar al linaje de megacariocitos/eritrocitos. Las PMPP derivan directamente de las CEH. (D) En el modelo de derivación mieloide, la población LT-HSC contiene CMRPs, MERPs y MkRPs. Estos MyRP son producidos directamente por las HSC. (E) Los subtipos de MPP se dividen en MPP1-4. El MPP1 puede dar lugar a todos los linajes. Los MPP2/3 son de tendencia mieloide y el MPP4 es de tendencia linfoide. Además, el MPP2 es de tendencia plaquetaria. (F) En este modelo, los MPP se diferencian en pre MegE, Pre GM y CLP. La pre MegE está por encima de la MkP y de la pre CFU-E. Pre GM da lugar a GMP, y posteriormente genera precursores de neutrófilos recién definidos (Pre Neu)
El origen de los megacariocitos ha sido objeto de debate durante varios años. El grupo de Jacobsen identificó los MPP con cebado linfático (LMPP) que dan lugar a linajes de granulocitos/macrófagos y linfáticos pero no a un linaje de megacariocitos/eritrocitos (Adolfsson et al., 2005) (Fig. 2C). Sin embargo, los estudios de rastreo de linaje desafían esta opinión y sugieren que las LMPP también se diferencian en un linaje de megacariocitos/eritrocitos (Forsberg et al., 2006; Boyer et al., 2011). Los diferentes resultados pueden atribuirse a la dosis celular utilizada para el trasplante y a los métodos, incluidos los modelos de ratón, utilizados en los diferentes laboratorios. Más recientemente, se sugirió que la expresión de ARNm del marcador megacariocítico factor von Willebrand (vWF) y el receptor de superficie c-Kit son indicativos de una subpoblación de CMH con sesgo plaquetario, pero multipotente (Sanjuan-Pla et al., 2013; Shin et al., 2014). El grupo de Jacobsen (Sanjuan-Pla et al., 2013) aportó pruebas de la existencia de una población de CMH con sesgo plaquetario. Descubrieron que el 25% de las CMH-LT expresan vWF y que las CMH vWF+ están preparadas para la expresión de genes específicos de las plaquetas, con una mayor propensión a la reconstitución de las plaquetas a largo plazo. Las CMH cebadas con plaquetas vWF+ también tienen un sesgo de linaje mieloide a largo plazo, pueden autorrenovarse y pueden dar lugar a CMH con sesgo linfoide vWF (Fig. 2C). Por lo tanto, las CMH cebadas con plaquetas se sitúan en la cima de la jerarquía hematopoyética. Además, basándose en experimentos de trasplante de una sola célula, se propuso la existencia de células restringidas al linaje de los megacariocitos en el compartimento fenotípico de las CEH (Yamamoto et al., 2013). El ensayo de trasplante de células pares indica que los precursores de megacariocitos se derivan directamente de las HSC (Yamamoto et al., 2013) (Fig. 2D). Posteriormente, un estudio informó de que el compartimento de las CEH contiene progenitores comprometidos de megacariocitos similares a tallos (SL-MkP), una población celular que comparte muchas características con las CEH (Haas et al., 2015). Esta población se activa ante el estrés inflamatorio para reponer eficazmente las plaquetas, por lo que se ha sugerido un posible atajo de las CMH a los megacariocitos en condiciones inflamatorias (Haas et al., 2015). Además, mediante el seguimiento de los progenitores y las células de linaje maduro producidas a partir de HSC individuales trasplantadas, un informe reciente del laboratorio de Jacobsen mostró que una clase distinta de HSC adopta un destino hacia la reposición efectiva y a largo plazo de megacariocitos/plaquetas sin la reposición de ningún otro linaje de células sanguíneas, mientras que ninguna HSC contribuye exclusivamente a ningún otro linaje de células sanguíneas individuales (Carrelha et al, 2018).
Colectivamente, las HSC y los megacariocitos comparten varias características, por ejemplo, la expresión del receptor de trombopoyetina (MPL), CD150, CXCR4 y vWF, etc. (Wang et al., 1998; Sugiyama et al., 2006; Pronk et al., 2007; Yoshihara et al., 2007; Huang y Cantor, 2009). Y lo que es más importante, los megacariocitos también son un componente del nicho de las CMH y regulan estrechamente el mantenimiento de la función de las CMH (Bruns et al., 2014; Zhao et al., 2014). Las HSC con sesgo plaquetario y mieloide vWF+, pero no las HSC con sesgo linfático vWF-, se asocian con los megacariocitos y son reguladas por estos (Pinho et al., 2018). Toda la evidencia sugiere que las HSC y el megacariocito (o sus progenitores) están más cerca uno del otro en la jerarquía de desarrollo hematopoyético de lo que se apreciaba anteriormente. Teniendo en cuenta la heterogeneidad observada en la población de CMH, nuestra opinión es que la predeterminación del linaje (destino celular) se produce en las CMH, antes de su diferenciación hacia los progenitores. Además, el megacariocito puede surgir independientemente de otros linajes, y la ruta de diferenciación de los megacariocitos se separa primero de otros linajes de células sanguíneas en la jerarquía.
Heterogeneidad en los MPP
Los estudios de Trumpp (Wilson et al, 2008) y Passegue (Pietras et al., 2015) dividieron además la población de MPP en MPP1, MPP2, MPP3 y MPP4 según su inmunofenotipo, estado del ciclo celular, sesgo de linaje, resistencia al tratamiento farmacológico y abundancia en la médula ósea. MPP1 es más similar a las IT-HSC o ST-HSC previamente definidas, que tienen capacidad de reconstitución de múltiples linajes hasta 4 meses en el primer trasplante, mientras que MPP2/3/4 carecen de potencial de autorrenovación y sólo muestran capacidad de reconstitución mieloide a corto plazo (<1 mes). Más importante aún, MPP2 y MPP3 producen bajos niveles de células T y B y MPP4 genera bajos niveles de células mieloides in vivo. Además, en comparación con MPP3 y MPP4, MPP2 produce niveles más altos de plaquetas. En conjunto, el MPP2 es un subconjunto de MPP con sesgo megacariocítico y el MPP3 es un subconjunto de MPP con sesgo mieloide. Tanto el MPP2 como el MPP3 son funcionalmente distintos del MPP4 de origen linfoide. Las CMH generan de forma independiente los tres tipos de MPP con sesgo de linaje (MPP2-4), pero entre ellos, ningún MPP es capaz de generar otros MPP in vivo (Fig. 2E). Tras el trasplante, las CMH producen primero MPP de sesgo mieloide (MPP1/2) para establecer rápidamente la producción mieloide, seguida de la subpoblación MPP4 de cebado linfoide para reconstruir el compartimento linfoide. Por lo tanto, los MPP son una población heterogénea con diferente potencial de linaje tanto a nivel celular como molecular.
Heterogeneidad y jerarquía dentro de los progenitores mieloides
En el modelo clásico, los MPC y los MPP se separan según la expresión de CD34. En la población Lin-cKit+Sca1- (LKS-), los CMP son CD34+CD16/32-, mientras que los MEP son CD34-CD16/32-. Se cree que las CMP poseen oligo-potencia, incluyendo potencial de diferenciación de granulocitos, macrófagos, megacariocitos y eritrocitos. Sin embargo, las CMP tienen una baja frecuencia clonal de colonias mieloides mixtas, y las MEP también poseen un bajo nivel de potencial megacariocítico (Nakorn et al., 2003). Por lo tanto, esto nos lleva a saber si cada CMP o MEP tiene un potencial de linaje diferente a nivel de célula única, es decir si cada CMP es realmente oligo-potente, y si el MEP es bipotente.
Para entender la heterogeneidad y el compromiso de linaje en la población de progenitores mieloides LKS-, especialmente en los CMP, Pronk et al. (Pronk et al., 2007) utilizaron CD150, CD105 (Endoglin), CD41 y CD16/32 para volver a segregar los progenitores mieloides LKS-. En la población LKS-, las células CD41+CD150+ se definen como progenitores megacariocíticos (MkP), que se asocian exclusivamente a la generación de megacariocitos. Las células CD41-CD150- CD16/32+ son GMP. En la población CD41-CD150-CD16/32- (mezcla clásica de CMPs y MEPs), hay cuatro subpoblaciones recientemente definidas, incluyendo las pre MegEs, las pre GMs, las Pre CFU-Es y las CFU-Es (Pronk et al., 2007). Las células Pre MegE individuales pueden producir eficazmente colonias megacariocíticas, eritroides y mixtas megacariocíticas/eritroides. Por el contrario, las células Pre CFU-E dan lugar casi exclusivamente a colonias eritroides de diversos tamaños. Las Pre GM se sitúan en una fase de desarrollo anterior a las GMP, y tienen una salida de linaje clonal notablemente similar a la de las GMP. Por lo tanto, el estudio de Pronk et al. explora los procesos de diferenciación de las células mieloides, revela una serie de nuevos progenitores intermedios y orquesta un nuevo modelo de jerarquía, que incluye precursores de neutrófilos proliferativos unipotentes (Kim et al., 2017; Evrard et al., 2018; Zhu et al., 2018). Los CMPs clásicos consisten en pre GMs, y la mayoría de pre MegEs y MEPs se separan en CFU-E, Pre CFU-Es, y parte de pre MegEs. Además, las MkP se localizan principalmente en las CMP (Pronk et al., 2007) (Fig. 2F).
En consonancia con el trabajo comentado anteriormente, un trabajo emblemático del laboratorio de Amit en el que se informaba de los transcriptomas de más de 2.600 células progenitoras mielo-eritroides individuales de ratón (Paul et al, 2015) y un trabajo posterior del laboratorio de Gottgens en el que se informaba de los transcriptomas de 1.600 HSPC (Nestorowa et al., 2016) revelaron la heterogeneidad de los progenitores LKS. Las células individuales de las MEP clásicas no muestran ninguna expresión de marcadores megacariocíticos ni de TFs megacariocíticos prominentes. Sin embargo, tanto los marcadores de megacariocitos (Pf4 y CD41) como los TFs (Pbx1, Fli1, Mef2c) se expresan en las células procedentes de los CMP clásicos (Paul et al., 2015).
En conjunto, todos los estudios explican por qué los megacariocitos se diferencian principalmente de los CMP, pero no de los MEP, y los MEP dan lugar principalmente a eritrocitos. Por lo tanto, esto sugiere que las MEP clásicas pueden no ser el verdadero precursor de los megacariocitos.
La diferenciación hematopoyética es un proceso continuo
Estudios anteriores indicaron que las HSC individuales adquieren gradualmente sesgos de linaje a lo largo de múltiples direcciones mientras pasan por poblaciones progenitoras discretas organizadas jerárquicamente (Fig. 3A). Sin embargo, estos modelos se basan en el análisis de poblaciones celulares predefinidas y clasificadas por flujo. Con los avances en las metodologías, se ha hecho posible estudiar las similitudes o diferencias de las HSPC individuales y sus relaciones de diferenciación.
(A) El modelo de diferenciación discreta muestra que las CMH se diferencian a un linaje maduro y que la progresión de las células es un proceso escalonado que sigue una jerarquía en forma de árbol de progenitores oligo, bi y unipotentes. (B) El modelo de diferenciación continua muestra que no hay un límite obvio en la jerarquía. Las HSC individuales adquieren gradualmente sesgos de linaje a lo largo de múltiples direcciones sin pasar por poblaciones progenitoras discretas organizadas jerárquicamente
Al utilizar scRNA-seq combinado con análisis computacional, un estudio reciente sobre HSPCs de médula ósea humana muestreadas exhaustivamente sugirió un modelo en el que la adquisición de destinos específicos de linaje es un proceso continuo, y las células de linaje restringido emergen directamente de un continuo de HSPCs indiferenciadas de bajo cebado, sin ninguna transición importante a través de las etapas multi y bipotenciales (Velten et al., 2017). Este punto de vista está respaldado por un estudio sobre el pez cebra que sugiere que el continuo de diferenciación de las HSPC se caracteriza por un programa transcripcional altamente coordinado, que muestra la supresión simultánea de los genes relacionados con la proliferación celular y la regulación al alza de los genes específicos del linaje (Macaulay et al., 2016). Además, otro estudio en el que se utilizaron células progenitoras linfomieloides de sangre de cordón umbilical humana, incluyendo LMPP, GMP y progenitores multilinfos (MLP), sugirió además un modelo en el que un continuo de progenitores ejecuta la diferenciación linfoide y mieloide, en lugar de que solo haya progenitores de un solo linaje aguas abajo de las células madre (Karamitros et al., 2018). Aunque la mayoría de los progenitores tienen un potencial uni-lineal, los progenitores bi- y oligo-lineales están presentes entre las LMPP, las GMP y las MLP. Estos estudios mencionados cambian nuestra visión de que la diferenciación hematopoyética es un proceso continuo, en lugar de una jerarquía discreta, lo que sugiere que no hay un límite obvio entre las células madre y los progenitores (Laurenti y Gottgens, 2018) (Fig. 3B).
La hoja de ruta de la hematopoyesis humana
En la hematopoyesis humana, el grupo de Dick clasificó las MPP, las CMP y las MEP del hígado fetal y de la médula ósea adulta, y comparó su potencial de linaje a partir de diferentes etapas de desarrollo (Notta et al, 2016). Demostraron que los MPP, CMP y MEP previamente definidos son heterogéneos. Es importante destacar que los MEP, tanto del hígado fetal como de la médula ósea, producen uniformemente clones sólo eritroides. Por lo tanto, los MEP definidos clásicamente son principalmente precursores eritroides cuando se analizan a resolución de una sola célula y no son progenitores megacariocíticos/eritroides como se pensaba anteriormente, lo que coincide con la observación en un modelo de ratón (Pronk et al., 2007). Curiosamente, el hígado fetal contiene un gran número de progenitores oligopotentes distintos. Sin embargo, en la médula ósea adulta había pocos progenitores oligopotentes. En su lugar, sólo predominan dos clases de progenitores, multipotentes y unipotentes, con linajes de megacariocitos/eritroides que surgen de células multipotentes. El estudio del grupo de Dick proporciona un modelo revisado para entender la hematopoyesis normal, que es efectivamente flexible en el tiempo de desarrollo.