En este dibujo del artista francés Jacques le Moyne de Morgues, los timucuas huyen de los colonos españoles, que llegan en barco. Le Moyne vivió en Fort Caroline, el puesto de avanzada francés, antes de que los españoles destruyeran la colonia en 1562.
España se afianzó en la actual Florida, viendo esa zona y las tierras del norte como una extensión lógica de su imperio caribeño. En 1513, Juan Ponce de León reclamó para la corona española la zona de la actual San Agustín, bautizando la tierra con el nombre de Pascua Florida por la festividad más cercana. Ponce de León no pudo establecer un asentamiento permanente allí, pero en 1565, España necesitaba un puesto de avanzada para hacer frente a los corsarios franceses e ingleses que utilizaban Florida como base para atacar a los barcos españoles cargados de tesoros que se dirigían de Cuba a España. La amenaza para los intereses españoles dio un nuevo giro en 1562 cuando un grupo de protestantes franceses (hugonotes) estableció un pequeño asentamiento al que llamaron Fort Caroline, al norte de San Agustín. Con la autorización del rey Felipe II, el noble español Pedro Menéndez dirigió un ataque contra Fort Caroline, matando a la mayoría de los colonos y destruyendo el fuerte. La eliminación del fuerte Caroline tuvo un doble propósito para los españoles: ayudó a reducir el peligro de los corsarios franceses y erradicó la amenaza francesa a la reclamación española de la zona. La contienda por Florida ilustra cómo las rivalidades europeas se extendieron a las Américas, especialmente el conflicto religioso entre católicos y protestantes.
En 1565, el victorioso Menéndez fundó San Agustín, el asentamiento europeo más antiguo de las Américas. En el proceso, los españoles desplazaron a los indios Timucua locales de su antigua ciudad de Seloy, que había permanecido durante miles de años. Los timucuas sufrieron mucho a causa de las enfermedades introducidas por los españoles, y pasaron de tener una población de unos 200.000 habitantes antes del contacto a cincuenta mil en 1590. En 1700, sólo quedaban mil timucuas. Al igual que en otras áreas de la conquista española, los sacerdotes católicos se esforzaron por llevar a cabo una conquista espiritual obligando a los timucuas supervivientes, desmoralizados y tambaleándose por las catastróficas pérdidas de sus familias y comunidades, a convertirse al catolicismo.
La Florida española era un objetivo atractivo para los rivales imperiales de España, especialmente los ingleses, que querían acceder al Caribe. En 1586, los colonos españoles de San Agustín descubrieron su vulnerabilidad a los ataques cuando el pirata inglés Sir Francis Drake destruyó la ciudad con una flota de veinte barcos y cien hombres. Durante las siguientes décadas, los españoles construyeron más fuertes de madera, todos ellos quemados por rivales europeos que realizaban incursiones. Entre 1672 y 1695, los españoles construyeron un fuerte de piedra, el Castillo de San Marcos, para defender mejor a San Agustín de sus rivales.
El fuerte español del Castillo de San Marcos ayudó a los colonos españoles de San Agustín a defenderse de los corsarios de países europeos rivales.