54.9.5 Aspectos de Estructura-Actividad de los Transportadores de Cbl
El factor intrínseco se une a la B12 con una constante de disociación superior a 1012 mol/L.361 En comparación con la haptocorrina, el factor intrínseco es único en dos aspectos. Se une a la B12 pero no al amplio espectro de corrinoides reconocidos por la haptocorrina y, a diferencia de ésta, no es digerido por las enzimas presentes en el tracto gastrointestinal superior. Estas características garantizan que sólo las formas de B12 reconocidas por el factor intrínseco se presentan para su absorción en el íleon terminal. El factor intrínseco es una proteína de una cadena de aminoácidos de ~ 50 kDa (417 aminoácidos). La proteína puede desintegrarse en dos partes: un fragmento N-terminal de 30 kDa y un fragmento C-terminal de 20 kDa. Curiosamente, cada una de estas dos partes reconoce la B12, pero si están juntas en solución, las parejas conjuntas se unen sólo a una molécula de B12.338 Estos hallazgos están de acuerdo con la estructura tridimensional del factor intrínseco que muestra que la B12 está intercalada entre la subunidad N-terminal α y la subunidad C-terminal β327,335 (Fig. 54.15). La estructura tridimensional también ofrece una explicación al hallazgo de que un factor intrínseco truncado 20-50 aminoácidos C-terminal ya no muestra una unión de alta afinidad de la B12.362 La parte C-terminal de la molécula contiene todos los enlaces de hidrógeno y la mayoría de los enlaces hidrofóbicos implicados en el reconocimiento de la B12 por la subunidad β de la molécula.
Desde hace tiempo se sabe que el factor intrínseco reconocerá las formas de B12 con diferentes ligandos superiores de manera comparable (por ejemplo, Met-B12 en comparación con CN-B12) y de acuerdo con este conocimiento la estructura cristalina predicha muestra que el ligando superior está expuesto al disolvente.305,327 La especificidad para la B12 encontrada por el factor intrínseco en comparación con la haptocorrina puede explicarse por la presencia de aminoácidos voluminosos como el triptófano y la tirosina en el bolsillo de unión de la B12 de la haptocorrina pero no del factor intrínseco.327
Se han descrito aproximadamente 10 pacientes con mutaciones en el gen GIF que codifica el factor intrínseco, pero dichas mutaciones no han aportado nada a nuestra comprensión de las relaciones estructura-función para la unión de la B12 al factor intrínseco, ya que la mayoría de ellas se explican por dos mutaciones sin sentido específicas.323,363 En la actualidad, no está claro si un intercambio del aminoácido número cinco de un ácido glutámico a arginina está relacionado con un deterioro de la función del factor intrínseco.327,364
El factor intrínseco es una glicoproteína, y se cree que la estructura de los carbohidratos es importante para su estabilidad frente a la degradación enzimática, aunque esto no se ha examinado lo suficiente, en parte porque la estructura de los carbohidratos del factor intrínseco humano sigue sin dilucidarse. Utilizando el factor intrínseco de rata, se ha demostrado que la fracción de carbohidrato no es importante para el reconocimiento de la B12 o para la unión del factor intrínseco a su receptor.365
La estructura del receptor de cubilina es bastante única. La cubilina reconoce al factor intrínseco, mientras que el amnionless proporciona anclaje a la membrana y capacidad endocítica a través de dos señales de secuencia de aminoácidos de fenilalanina-alguna-asparagina-prolina-alguna-fenilalanina (FXNPXF) dentro del dominio citosólico. Las dos señales promueven la internalización de todo el complejo a través de la unión a las proteínas de clasificación asociadas a la clatrina disabled-2 (Dab2) y a la hipercolesterolemia autosómica recesiva (ARH).366 La parte amnionless de cubam se identificó a partir del análisis de equilibrio de ligamiento de pacientes con el síndrome de Imerslund-Gräsbeck que no albergaban mutaciones en el gen de la cubilina, y posteriormente se han relacionado varias mutaciones en amnionless con esta enfermedad con clusters en Noruega y en las regiones mediterráneas.325,344 Estudios elaborados en ratones y en un modelo de perro que presenta mutaciones espontáneas en el gen amnionless han demostrado que la proteína es esencial no sólo para la internalización de los ligandos unidos a la cubilina, sino también para escoltar a la cubilina a la superficie de las células.316,367 El resultado implica que no se expresa cubam en la superficie celular si la amnionless está deteriorada y, como consecuencia, se compromete la absorción de B12.368
La parte de cubam que reconoce el factor intrínseco B12 es la cubilina. El complejo ha sido cristalizado (Fig. 54.15).342 Las subunidades β- y α del factor intrínseco participan en la unión dependiente del calcio que también requiere la presencia de B12 como se predijo anteriormente por estudios sobre la unión de las dos subunidades del factor intrínseco a la cubilina.339 La parte N-terminal de la cubilina, incluyendo los dominios CUB 5-8, es la responsable de reconocer el facto intrínseco y la estructura cristalina indica que los dominios de unión son el CUB 6 y el CUB 8342,369 La importancia del CUB 5-8 se basa en la observación de que la mutación de la cubilina que intercambia prolina por leucina en la posición 1297 compromete la unión entre la cubilina y el factor intrínseco.370 Esta mutación concreta se ha observado en pacientes finlandeses que padecen el síndrome de Imerslund-Gräsbeck, aunque también se han relacionado con la enfermedad otras mutaciones en cubilina.325
Aunque la relación estructura-función para la unión del factor intrínseco a la cubilina está bien documentada, se conoce mucho menos sobre la especificidad para la unión de otras proteínas a la cubilina. En el riñón, el receptor de cubilina participa en la reabsorción proximal de una variedad de proteínas, incluyendo la proteína de unión a la vitamina D (Gc), la transferrina y la albúmina (para una revisión, véase la ref. 326). En consecuencia, muchos pacientes con el síndrome de Imerslund-Gräsbeck muestran una mayor excreción de algunas de estas proteínas en la orina. Los estudios que aclaran la relación entre los cambios específicos en la cubilina y las proteínas que se producen en la orina pueden descubrir relaciones adicionales entre la estructura y la función.