Diferenciación rápida de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina y Staphylococcus aureus susceptible a la meticilina a partir de cultivos de sangre mediante el uso de una prueba de difusión en disco de cefoxitina directa

La incidencia de las infecciones del torrente sanguíneo por Staphylococcus aureus adquiridas en la atención sanitaria y en la comunidad ha aumentado significativamente en las últimas décadas (20). El informe del Sistema Nacional de Vigilancia de las Infecciones Nosocomiales, de enero de 1992 a junio de 2001, indica que más del 55% de los aislados de S. aureus eran resistentes a la meticilina, la oxacilina o la nafcilina (16). Los factores de riesgo asociados a la bacteriemia por S. aureus resistente a la meticilina (SARM) son los siguientes: residencia en un centro de cuidados prolongados, exposición previa a antibióticos, diabetes insulinodependiente, hospitalización prolongada, cateterismo urinario, colocación de una sonda nasogástrica, cirugía previa y padecer una enfermedad subyacente (13, 18, 19). La población de edad avanzada (≥65 años) tiene un riesgo significativamente mayor de muerte por bacteriemia por SARM que las poblaciones más jóvenes (18, 22).

La infección por SARM sitúa al paciente en un riesgo mayor de sufrir otros problemas de salud. La bacteriemia por SARM se ha asociado a un mayor riesgo de insuficiencia renal aguda, a estancias más prolongadas en el hospital y en la unidad de cuidados intensivos, al desarrollo de dependencia del ventilador y a un aumento de los costes hospitalarios (1, 6, 15). Varios estudios han demostrado que los pacientes con infecciones del torrente sanguíneo por SARM tienen un riesgo de mortalidad significativamente mayor que los pacientes con infecciones del torrente sanguíneo por S. aureus sensible a la meticilina (MSSA) (1, 5, 19). Se estima que las tasas de mortalidad de los pacientes que desarrollan bacteriemia por SARM se sitúan entre el 23% y el 54% (1, 8).

También se ha demostrado que los pacientes con bacteriemia por SARM tienen un mayor riesgo de retraso en el tratamiento (15). La elección inadecuada de antibióticos para los pacientes con bacteriemia por S. aureus también se ha asociado con mayores tasas de mortalidad hospitalaria (10). Las terapias inadecuadas consistieron en β-lactámicos para la bacteriemia por SARM y vancomicina para la bacteriemia por SASM. La elección inicial de vancomicina para la bacteriemia por MSSA se ha asociado con una mayor incidencia de retraso en la eliminación de la infección, y el retraso en la terapia adecuada para los pacientes con MRSA es un predictor independiente de mortalidad (10, 15).

La elección de la terapia para las infecciones del torrente sanguíneo se ha vuelto crítica con el aumento de la resistencia a los antibióticos que se observa con muchos organismos. El aumento de los organismos grampositivos resistentes a la vancomicina amenaza muchos regímenes de tratamiento aceptados y justifica el uso empírico de los glucopéptidos para las infecciones del torrente sanguíneo (12). Por lo tanto, la caracterización más rápida de los aislados de S. aureus procedentes de los hemocultivos como resistentes o susceptibles a la oxacilina es un factor importante para el tratamiento rápido y preciso de los pacientes bacteriémicos.

Las muestras de hemocultivos se recogieron en frascos aeróbicos y anaeróbicos (frascos BacT/Alert FA y BacT/Alert FN; bioMérieux, Durham, NC) y se analizaron en el BacT/Alert 3D (bioMérieux, Durham, NC). Las muestras de hemocultivos que mostraban «cocos grampositivos en racimos» en las tinciones de Gram se impregnaron en un hisopo de una alícuota derivada del frasco de sangre utilizando la misma técnica que se emplearía en la preparación de una prueba de susceptibilidad por difusión en disco (3). A continuación, se utilizó el hisopo para rayar toda la superficie de una placa de agar sangre de soja tríptica de 100 mm (BD BBL, Franklin Lakes, NJ), como también se haría para una prueba de difusión en disco. Posteriormente, se colocó un disco de cefoxitina (BBL Sensi-Disc, Franklin Lakes, NJ) en el centro de la placa, y las placas se incubaron durante toda la noche (de 10 a 24 h) a 35-37°C en aire ambiente. A la mañana siguiente, se midieron y registraron los tamaños de las zonas de cefoxitina. Los resultados del tamaño de la zona de cefoxitina medidos se compararon con los resultados obtenidos con las pruebas de confirmación. Los ensayos de confirmación incluyeron la prueba de susceptibilidad del organismo aislado a la oxacilina mediante la tarjeta de susceptibilidad Vitek 2 GP-63 (bioMéreiux, Durham, NC) y la prueba estandarizada de difusión en disco de cefoxitina (3, 4). Los organismos se identificaron como S. aureus mediante una prueba de coagulasa en tubo de 4 horas realizada directamente a partir del caldo del hemocultivo; las identificaciones se comunicaron el mismo día en que se determinó que el hemocultivo era positivo. Si la coagulasa directa en tubo era negativa, se realizaban pruebas de coagulasa en portaobjetos y/o en tubo en las colonias aisladas a la mañana siguiente, cuando se leían los tamaños de las zonas de cefoxitina.

Se analizaron un total de 782 muestras de hemocultivos, de las cuales 276 crecieron un cultivo puro de S. aureus (procedentes de 103 pacientes). En 489 muestras crecieron estafilococos coagulasa-negativos (ECN), en 12 crecieron especies de Micrococcus, en 4 crecieron tanto S. aureus como ECN, y en 1 crecieron especies de Micrococcus y ECN. De los 276 cultivos puros de S. aureus, 105 (38,1%) tenían tamaños de zona de cefoxitina directa que medían ≤17 mm, 18 (6,5%) tenían los que medían 18 mm, 8 (2,9%) tenían los que medían 19 mm, 8 (2,9%) tenían los que medían 20 mm, y 137 (49,6%) tenían los que medían ≥21 mm (Fig. 1). Todas las muestras que tenían tamaños de zona que medían ≤17 mm con la prueba del disco de cefoxitina directa se confirmaron como resistentes a la oxacilina por ambos métodos de confirmación, y todas las muestras con tamaños de zona que medían ≥21 mm con la prueba del disco de cefoxitina directa se confirmaron como susceptibles a la oxacilina por ambos métodos de confirmación. Así, la detección de SARM o MSSA en los hemocultivos pudo notificarse entre 10 y 24 h antes para el 88% de los cultivos con total precisión.

Treinta y cuatro muestras con tamaños de zona que medían entre 18 y 20 mm contenían una combinación de aislados de SARM y MSSA. De estas 34 muestras, 29 (85,3%) se confirmaron como SARM y 5 (14,7%) se confirmaron como MSSA. Este rango de tamaño de zona se describió entonces como «indeterminado», ya que los resultados de la oxacilina para los organismos que caen en este rango no pudieron determinarse mediante la prueba directa de disco de cefoxitina con una precisión del 100%, sino que deben esperar a que se realicen pruebas de confirmación. Incluso se podría considerar que todos los organismos con diámetros de zona de entre 18 y 20 mm son presuntos SARM, ya que se determinó que más del 85% de estas muestras eran SARM tras las pruebas de confirmación. Estos rangos de zona (SARM, ≤20 mm; MSSA, ≥21 mm) harían que la precisión de la prueba directa del disco de cefoxitina >96%.

Se evaluaron los tiempos de incubación de todos los aislados del estudio con diámetros de zona de 18 a 20 mm para determinar si era probable que las muestras con tiempos de incubación más cortos dieran lugar a tamaños de zona indeterminados. De las 34 muestras que entraron en el rango de zona indeterminada, 3 (9%) tuvieron tiempos de incubación de 10 a 15 h, 9 (26%) se incubaron entre 15 y 20 h, y 22 (65%) se incubaron entre 20 y 24 h. No hubo correlación entre los tiempos de incubación y los diámetros de las zonas indeterminadas; la mayoría de las muestras indeterminadas tuvieron incubaciones completas de entre 20 y 24 h, y el <10% tuvo <15 h de incubación.

Evaluando las muestras por paciente, 39 de los 103 pacientes tenían MRSA, y 64 tenían MSSA. Utilizando el primer hemocultivo positivo de cada paciente, 8 de los 39 pacientes con SARM tuvieron resultados indeterminados (diámetros de zona de entre 18 y 20 mm), al igual que 2 de los 64 pacientes con MSSA. Así, evaluando el primer hemocultivo positivo del paciente con la prueba de disco de cefoxitina directa para determinar el resultado de la oxacilina, 93 de los 103 (>90%) organismos de los pacientes habrían sido denominados con una precisión del 100% utilizando los parámetros de diámetros de zona de ≤17 mm para el SARM y de ≥21 mm para el MSSA, lo que se aproxima mucho al 88% observado al analizar cada hemocultivo. Aunque no vimos ninguna infección mixta de SARM y MSSA (una seguida de la otra en las siguientes extracciones de hemocultivos), recomendamos analizar todos los «cocos grampositivos en racimos» de los hemocultivos con la prueba de disco de cefoxitina directa, ya que este escenario podría darse.

La necesidad de diferenciar el SARM del MSSA de las muestras de hemocultivos de manera oportuna es de importancia para proporcionar la mejor atención a los pacientes mediante el uso de los antibióticos adecuados lo antes posible. Varios mecanismos para determinar las especies de Staphylococcus y/o los resultados de la oxacilina directamente a partir de los frascos de hemocultivo incluyen el agar cromogénico de diferenciación selectiva (17), métodos de identificación directa como la prueba BBL Crystal MRSA ID (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD) (11), y métodos moleculares, incluyendo el ensayo BD GeneOhm StaphSR (Becton Dickinson, Sparks, MD), la prueba de hemocultivo Xpert MRSA/SA de Cepheid (Sunnyvale, CA), la detección multiplex de mecA y los genes nuc (12), detección de los genes mecA y orfX por PCR en tiempo real (21), y el ensayo IDI en tiempo real (Infectio Diagnostic, Sainte-Foy, Quebec, Canadá) utilizando el SmartCycler (Cepheid, Sunnyvale, CA) (7). Además, la prueba de aglutinación del látex del SARM PBP2a (Oxoid Ltd., Basingstoke, Reino Unido) podría utilizarse la mañana siguiente al subcultivo de las muestras positivas si se produce un crecimiento suficiente (depende del tiempo de incubación). Esto daría un tiempo de respuesta similar al de nuestro protocolo; sin embargo, la prueba de látex de PBP2a requiere colonias bien aisladas, funciona de forma más eficiente cuando se hace por lotes, requiere tiempo adicional del personal para las pruebas y es más costosa.

Todas las técnicas mencionadas anteriormente utilizan recursos de laboratorio adicionales, como sistemas de identificación de kits y/o medios especializados o ensayos moleculares. Aunque son rápidas y precisas, estas pruebas suelen utilizarse mejor para las pruebas por lotes, son todas más costosas y requieren más mano de obra para el laboratorio y, con las pruebas moleculares, a menudo pueden requerir conocimientos moleculares adicionales e instrumentos que pueden no estar fácilmente disponibles. Este estudio describe un enfoque para determinar el resultado de la oxacilina de los aislados de S. aureus directamente a partir de muestras de hemocultivos que puede utilizarse de forma rentable y precisa y que no necesita ser sometido a pruebas por lotes, sino que puede leerse de forma rápida e individual en cada estación de trabajo. Es comprensible que el laboratorio analice todos los hemocultivos que muestren cocos grampositivos en racimos, pero como los materiales y la experiencia necesarios para realizar la prueba directa del disco de cefoxitina ya forman parte del laboratorio de microbiología de diagnóstico rutinario, el coste añadido de una placa de agar sangre de soja tríptica y un disco de cefoxitina bien merece el modesto gasto (∼0,50 dólares/cultivo de AAS) para poder informar más rápidamente sobre el MSSA o el MRSA a partir de los hemocultivos. Para los resultados directos del disco de cefoxitina de tamaños de zona ≤17-mm o ≥21-mm, la precisión de la notificación de los resultados de oxacilina para los aislados de S. aureus fue del 100%. Utilizando este protocolo, el laboratorio puede dar un resultado exacto de oxacilina hasta 24 h antes que esperar a que se completen las susceptibilidades de rutina. Cabe señalar que estos puntos de ruptura se determinaron mediante los resultados de este estudio y no coinciden exactamente con los publicados por el CLSI para la evaluación de la resistencia a la oxacilina mediante el uso de discos de cefoxitina de colonias aisladas de estafilococos (4). Además, como este estudio no se basó en las directrices del CLSI, se eligió el agar sangre para su uso en lugar del clásico agar Mueller-Hinton utilizado en los protocolos de prueba estandarizados, ya que el agar sangre era menos costoso (en aproximadamente un 40% en nuestra institución) y estaría más fácilmente disponible para los laboratorios que utilizan principalmente instrumentación automatizada para las pruebas de susceptibilidad.

Al informar más rápidamente de los resultados de oxacilina para los aislados de S. aureus de los casos de bacteriemia, los pacientes podrían ser tratados antes con el antibiótico más eficaz. El tratamiento adecuado y rápido de un paciente con el antibiótico más eficaz disminuirá las complicaciones para el paciente, reducirá la duración de la estancia hospitalaria del paciente y disminuirá la morbilidad y la mortalidad del paciente, lo que supondrá un mayor ahorro para las instituciones médicas (10, 14, 15, 18). Además, el uso más adecuado de la vancomicina disminuirá la aparición de resistencia a este fármaco en los organismos grampositivos (2, 9).