Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos

ITG SUBJECT: ENDOTOXINAS BACTERIANAS/PIRÓGENOS

Introducción

Recientemente se ha discutido mucho en la literatura sobre la prueba de endotoxinas bacterianas, su significado e interpretación y su comparación con la prueba del conejo de la USP. El tema ya se trató brevemente a través de la Guía Técnica de Inspección nº 32, con fecha 1/12/79, con el tema: Los pirógenos, todavía un peligro.

Debido a la creciente aceptación y uso de la prueba de endotoxinas bacterianas, la ITG nº 32 se está actualizando.

La USP reconoce ahora dos pruebas: la prueba de pirógenos realizada con conejos y la prueba de endotoxinas bacterianas, también denominada prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Además, la agencia ha aprobado el uso de la prueba de endotoxinas bacterianas para muchos productos farmacéuticos y dispositivos. Este ITG se centrará en el significado y la interpretación de las pruebas de pirógenos/endotoxinas. También se discutirán las fuentes y los métodos de despirogenización. Las limitaciones de la prueba de pirógenos en conejo deben reconocerse al revisar los sistemas durante las inspecciones de los fabricantes de medicamentos y dispositivos estériles.

Historia

El Registro Federal, del 18 de enero de 1980, propuso directrices para determinar las endotoxinas con la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Posteriormente, el proyecto de directrices fue revisado y reeditado en 1983. La USP XX, 5º suplemento, revisó la prueba de endotoxinas bacterianas. Sin embargo, a diferencia del proyecto de directriz de la FDA, no se incluyeron disposiciones para volver a realizar la prueba. La mayoría de los fabricantes se encuentran en alguna fase de validación de la Prueba de Endotoxinas Bacterianas para sus productos.

El subcomité de la USP responsable de las revisiones de los métodos de prueba compendiales y/o de las monografías de productos ha realizado, en los últimos años, algunos cambios significativos en los requisitos de la prueba de endotoxinas bacterianas y de las monografías de productos. En 1984, cinco productos de agua de la USP recibieron límites específicos de endotoxinas bacterianas. El agua para inyección, el agua estéril para inyección y el agua estéril para riego tienen un límite de endotoxinas permitido de 0,25 unidades de endotoxinas (EU)/ml. (UE=Unidad de medida de la actividad de las endotoxinas). Sin embargo, al Agua Bacteriostática para Inyección y al Agua Estéril para Inhalación se les ha asignado un límite de endotoxinas bacterianas ligeramente superior, de 0,5 EU/ml (USP – Suplemento 4a – 1984). La agencia ha reconocido las ventajas de la prueba de endotoxinas bacterianas, en particular con respecto a la sensibilidad, la reproducibilidad, el alcance y la simplicidad. Además, tanto las inspecciones como los programas de pruebas de la FDA han identificado niveles objetables de endotoxinas en medicamentos y dispositivos.

Algunos productos acabados sometidos a pruebas, aunque no se consideren procesables debido a la baja dosis de producto que se va a administrar, podrían ser indicativos de problemas de pirógenos en otros sistemas, como un sistema de agua para inyección. Por ejemplo, un producto concreto, como la cianocobalamina inyectada, puede tener una concentración de endotoxinas de 10 EU/ml y considerarse conforme. Sin embargo, se podría cuestionar el Sistema de Agua para Inyección (WFI) del fabricante, ya que el Sistema WFI debería tener un nivel de 0,25 EU/ml.

Existe una considerable discusión en la literatura relativa a la endotoxicidad frente a la pirogenicidad. Muchos de los investigadores y revisores de los informes de inspección de la FDA desconocen las limitaciones de la prueba del conejo de la USP como prueba de endotoxina. Por ejemplo, Elin, en la Annual Review of Medicine, comentó que «la administración repetida de lipopolisacáridos (LPS), nombre químico utilizado como sinónimo de endotoxinas bacterianas, a animales de experimentación da lugar a una disminución progresiva de algunos de los efectos biológicos, especialmente la fiebre. Se desconoce el mecanismo preciso de este fenómeno, denominado tolerancia a la endotoxina». Además, algunos estudios han demostrado que la endotoxina del bacilo del legionario tiene un espectro de toxicidad diferente al de los organismos gramnegativos más comunes. En particular, la endotoxina del bacilo del legionario no era muy pirogénica (en la prueba del conejo), pero era muy activa en la LAL, con una diferencia de 1.000 veces entre las dos pruebas. En esta situación, la prueba del conejo es inadecuada para determinar la potencia de las toxinas presentes.

La prueba de pirógenos de la USP tiene limitaciones adicionales además de la tolerancia a la endotoxina y la baja reactividad a la endotoxina del legionario. Entre ellas está su variabilidad en los resultados de la prueba cuando se compara con la misma preparación de endotoxina estandarizada. En esta condición influyen la variación estacional, los factores interlaboratorios, las características de los conejos entre especies y otras influencias biológicas. La prueba es inadecuada para ciertas clases de fármacos, incluyendo radiofármacos, agentes quimioterapéuticos para el cáncer, hipnóticos y narcóticos, vitaminas, esteroides y ciertos antibióticos. Se ha comprobado que los pirógenos aparentes del producto pueden quedar «enmascarados» por la actividad fisicoquímica de los componentes del fármaco terapéutico. Además, la prueba del conejo no es lo suficientemente sensible para la detección de endotoxinas en productos farmacológicos intratecales.

También se reconoce poco la importancia clínica de las endotoxinas. Posiblemente esto se deba a que el efecto patógeno más enfatizado de las enfermedades gramnegativas es la producción de fiebre, y de todos los efectos de la endotoxina, la fiebre es probablemente el menos importante desde el punto de vista biológico y clínico.

Aunque muchos fabricantes están trabajando con LAL, todavía hay algunos fabricantes que son reacios a emplear LAL porque es demasiado sensible.

Además de la sensibilidad de la prueba, se puede probar un mayor número de unidades de dosificación/dispositivos utilizando LAL. Por ejemplo, se encontró que un dispositivo crítico estéril tenía un nivel de endotoxinas aceptable a partir de una muestra conjunta. (Nota: la prueba de pirógenos de la USP se realiza en una muestra conjunta.) Sin embargo, cuando se probaron extractos de unidades con LAL individualmente, se observaron fallos ocasionales. Una situación similar ocurrió en una muestra de Agua Bacteriostática para Inyección. Una muestra conjunta de varias unidades presentaba niveles de endotoxinas inferiores a 0,5 EU/ml. Sin embargo, se descubrió que algunas unidades de dosificación específicas superaban este límite de 0,5 EU/ml de la USP y se adoptaron medidas reglamentarias.

Características de la endotoxina bacteriana

El «pirógeno microbiano» en contraposición a la «endotoxina bacteriana gramnegativa» se ha convertido en un término descriptivo general para muchas sustancias diferentes. Sin embargo, las sustancias pirogénicas pueden ser producidas por algunas bacterias grampositivas, micobacterias, hongos y también virus, pero los pirógenos producidos por las bacterias gramnegativas, es decir, las endotoxinas, son de importancia para la industria farmacéutica.

Las endotoxinas bacterianas, que se encuentran en la membrana externa de las bacterias gramnegativas, son miembros de una clase de fosfolípidos llamados lipopolisacáridos (LPS). Los LPS no son productos exógenos de las bacterias gramnegativas. La liberación de LPS de las bacterias tiene lugar tras la muerte y lisis de la célula. Buenos ejemplos de bacterias gramnegativas productoras de pirógenos son Escherichia coli, Proteus, Pseudomonas, Enterobacter y Klebsiella.

Fórmula utilizada para calcular el límite de endotoxina para productos farmacéuticos individuales

Los efectos de la endotoxina están relacionados con la cantidad de endotoxina en la dosis de producto administrada a un paciente. Dado que la dosis varía de un producto a otro, el límite de endotoxinas se expresa como K/M. K es 5,0 EU/kilogramo (kg.), que representa la dosis umbral aproximada de pirógenos para humanos y conejos. Este es el nivel a partir del cual un producto se considera pirogénico o no pirogénico. M representa la dosis de prueba de pirógenos en conejos o la dosis máxima en humanos por kilogramo que se administraría en un solo período de una hora, lo que sea mayor. Si un producto está etiquetado para inyección intratecal, entonces K es 0,2 EU/kg. Sin embargo, hay 5 productos acuosos (anteriormente comentados) que, debido a los grandes volúmenes que pueden administrarse y a la ausencia de limitación de dosis, tienen límites específicos de endotoxinas por ml.

Ejemplo 1 – Un producto farmacológico no intratecal que tiene una dosis máxima para humanos de 10 ml/kg.

Límite de endotoxinas = K 5 EU/kg – = ——- = 0,5 EU/ml M 10 ml/kg

Ejemplo 2 – Producto: Cianocobalamina Inj. Potencia: 1000 mcg/ml

Dosis máxima/kg 14,3 mcg/kg (ver etiquetado del producto)

Límite de tolerancia a la endotoxina = 5,0 EU/kg – medicamento no intratecal

Límite de endotoxina = K 5.0 EU/kg – = ——— = 0,35 EU/mcg M 14,3 mcg/kg

Este valor (0,35 EU/mcg) se expresa en Unidades de Endotoxina por mcg de producto. Para convertir este valor en una concentración de unidades de endotoxina por ml, multiplíquelo (0,35 EU/mcg) por la potencia del producto (véase más abajo).

1000 mcg/ml x 0,35 EU/mcg = 350 EU/ml

Este valor determinado significa que si un fabricante de medicamentos parenterales está utilizando el método LAL para el ensayo de endotoxinas de Cyanocobalamin Inj, el producto no puede tener más de 350 EU/ml de producto.

Métodos de LAL – Algunas debilidades inherentes

La FDA y la USP han reconocido la validez de varios enfoques para el uso de LAL para las pruebas de endotoxinas. Hay cuatro métodos básicos disponibles comercialmente y actualmente aprobados por la FDA para las pruebas de liberación de productos finales: (i) el gel-clot; (ii) el turbidimétrico (espectrofotométrico); (iii) el colorimétrico (proteína de Lowry); y (iv) el ensayo cromogénico. Los reactivos de LAL utilizados en estos métodos deben obtenerse de un fabricante autorizado por la FDA y deben estar diseñados específicamente para el método elegido. Muchos de los otros métodos de LAL que aparecen en la literatura son modificaciones del ensayo de coágulos de gel o turbidimétrico y algunos han sido diseñados para utilizar menos LAL que el método básico.

Se sabe que ciertos productos interfieren con la capacidad de la LAL para reaccionar con la endotoxina. Estos factores pueden ser químicos o físicos. Los inhibidores químicos provocan la quelación de los cationes divalentes necesarios para la reacción de la LAL (por ejemplo, el EDTA), la desnaturalización de las proteínas (por ejemplo, la fluoresceína) o la alteración del pH (por ejemplo, un pH fuera del rango de 6,0 a 7,5). Los inhibidores físicos incluyen la adsorción de endotoxina o la viscosidad del producto. La mayoría afectará a todos los métodos, aunque el grado de inhibición puede variar. Sin embargo, la mayor parte de la inhibición puede superarse mediante la dilución del producto. Otros factores, como la forma y el tipo de material de vidrio utilizado en la prueba de coágulos de gel, también pueden afectar a la validez de la prueba. Por ejemplo, la cristalería siliconada, así como el plástico, pueden inhibir la formación de coágulos de gel o impedir lecturas espectrofotométricas precisas del punto final de la mezcla de reacción.

Los métodos turbidimétrico y cromogénico no pueden utilizarse con ciertos productos turbios o coloreados. Además, la formación de precipitados, aunque es inhibidora, puede confundirse con una respuesta positiva en estos métodos. Un problema asociado al uso del método cromogénico es la formación de un precipitado tras la adición de ácido para detener el desarrollo del color. Los productos que requieren un pH neutro o básico para la solubilidad son los más propensos a causar este problema.

No se puede dejar de insistir en la necesidad de validar la fiabilidad y precisión del método LAL para cada producto analizado. Los fabricantes pueden demostrarlo inoculando el producto con niveles bajos de endotoxina y ensayando su recuperación. Las concentraciones de endotoxina utilizadas deben estar dentro del rango inferior de la sensibilidad del lisado. Además, varios investigadores han descubierto que incluso la selección de la fuente del reactivo del lisado (es decir, el fabricante del lisado) puede contribuir a la variabilidad de los resultados del ensayo. Por lo tanto, si se realiza cualquier cambio en la fuente de reactivos, la prueba debe volver a validarse.

Se han realizado varias revisiones de los procedimientos analíticos descritos en la prueba de endotoxina bacteriana desde que se publicó por primera vez en 1980. Estos cambios han permitido que el método de LAL sea más fiable como ensayo de referencia de compendio. Los cambios significativos son (i) Tras la dilución de la endotoxina a través de un conjunto paralelo de soluciones, una que contenga agua y la otra producto con pH ajustado, el punto final de las mezclas de reacción entre los dos conjuntos no debe diferir en más de una diferencia de dos veces; (ii) Si el producto afecta a la mezcla de ensayo del lisado, entonces puede utilizarse cualquier dilución entre el punto final de inhibición y la MVD; (iii) El máximo que puede diluirse un producto para el ensayo debe determinarse utilizando la fórmula de dilución máxima válida (MVD). La fórmula se basa en la dosis del producto, el límite de tolerancia de endotoxinas y la sensibilidad del lisado. La dilución del producto más allá de este factor determinado hará que un resultado negativo no tenga sentido. Las concentraciones de endotoxinas nocivas pueden diluirse por debajo del rango detectable del lisado; (iv) Procedimientos imprecisos para lavar las endotoxinas bacterianas de los productos sanitarios. Se menciona la atención cuidadosa para no utilizar volúmenes excesivos para el lavado del producto.

Fuentes

Puede haber varias fuentes de pirógenos en los productos parenterales y de dispositivos médicos. Las fuentes habituales son: el agua utilizada como disolvente o en el procesamiento; los componentes del envase; los productos químicos, las materias primas o los equipos utilizados en la preparación del producto. Las buenas prácticas incluirían el control de los niveles de contaminación microbiológica y de endotoxinas en las fuentes potenciales mencionadas anteriormente.

En el caso de los productos parenterales, las inspecciones han demostrado que cuando se encontraron problemas de pirógenos en las formas farmacéuticas, y cuando la fuente era una de las materias primas, era el principio activo del medicamento. Esto era especialmente cierto en el caso de los fármacos en los que se utilizaba agua de proceso en alguna fase tardía del proceso de síntesis. Los niveles de endotoxinas de la sustancia farmacológica se redujeron posteriormente cuando se redujeron los niveles microbiológicos del agua de proceso y se controló el sistema de agua de proceso.

Además, si la sustancia farmacológica se produce biológicamente, la eliminación incompleta del microorganismo durante la purificación puede dar lugar a que la sustancia farmacológica tenga altos niveles de endotoxinas. Algunos ejemplos son los antibióticos producidos por fermentación o los subproductos de las bacterias gramnegativas utilizadas para producir productos farmacéuticos de ingeniería genética. Se está evaluando el uso potencial de la levadura en este ámbito para eliminar este problema.

Los procedimientos generales de procesamiento de los componentes físicos de los productos parenterales, como los tapones y los viales, prevén el lavado de estos componentes con agua libre de pirógenos antes de la esterilización. Una buena práctica incluiría la mínima manipulación del componente después del lavado y la rápida esterilización, especialmente si se esteriliza con vapor. El almacenamiento de tapones húmedos no estériles podría conducir a un aumento de los microorganismos y posiblemente de los niveles de endotoxinas.

Otra fuente de endotoxinas es el sistema de Agua para Inyección (WFI) o agua libre de pirógenos. Como comentario general, los sistemas de agua caliente circulante (por encima de 75 C) proporcionan el entorno menos propicio para el crecimiento microbiano y la formación de endotoxinas. Los sistemas de agua circulante para inyección a temperaturas más bajas (a unos 60 C) están algo (marginalmente) controlados por la temperatura del sistema. Existe cierta preocupación de que pueda haber algunos organismos patógenos gramnegativos, como la Legionella pneumophilia, que sobrevivan y crezcan a 57 C. Hay mucha información sobre la presencia de L. pneumophilia en los sistemas de agua caliente de los hospitales. La literatura ha demostrado que elevar periódicamente la temperatura de estos sistemas de agua caliente a 75 – 80 C ha eliminado el organismo.

En general, los sistemas de WFI a temperatura ambiente presentan el mayor problema. Muchos de los microorganismos objetables que son buenas fuentes de endotoxinas crecen bien en sistemas WFI fríos. Esto es particularmente cierto en los sistemas de ósmosis inversa (OI). Se ha reconocido que, dado que los filtros de ósmosis inversa no son absolutos, puede ser necesario tenerlos en serie para fabricar WFI libre de pirógenos.

Como se ha comentado anteriormente, el crecimiento de algunos tipos de microorganismos contribuye a aumentar los niveles de endotoxinas. Las soluciones a granel no estériles en proceso o formuladas, particularmente las soluciones sin conservantes, son un buen entorno para el crecimiento microbiano. No es una práctica habitual que los fabricantes realicen pruebas de endotoxinas en estas soluciones. La mayoría realiza pruebas microbiológicas para determinar el nivel microbiológico (carga biológica) antes de someter la solución a un proceso de esterilización. Sin embargo, para determinar el potencial de altos niveles de endotoxinas, sería aconsejable realizar pruebas microbiológicas antes de realizar cualquier paso de esterilización. Por ejemplo, si un producto es formulado y filtrado antes de una esterilización final, la prueba microbiológica de la carga biológica después de la filtración proporcionará alguna información útil para la determinación de la adecuación del proceso de esterilización. Sin embargo, proporcionará poca información, si es que hay alguna, relativa a la adecuación del proceso con respecto a la minimización de la contaminación por endotoxinas. Dado que las endotoxinas son el resultado de niveles elevados de microorganismos, y no se eliminan mediante filtros esterilizadores o microbiológicos, la reducción posterior de un nivel microbiológico elevado no se asociará con una reducción similar del nivel elevado de endotoxinas.

Al igual que ocurre con los productos farmacéuticos parenterales, en ocasiones se ha demostrado que los dispositivos estériles están contaminados con endotoxinas. Las fuentes han sido el agua que de alguna manera entró en el proceso de fabricación. Por ejemplo, el lavado de componentes como los medios filtrantes que se van a utilizar para la fabricación de filtros, o el lavado/enjuague de tubos u otros dispositivos de plástico antes de la posterior esterilización son fuentes potenciales de endotoxinas.

Depirogenación

Es difícil eliminar las endotoxinas de los productos una vez presentes. Es mucho mejor mantener los productos acabados y los componentes relativamente libres de endotoxinas que tener que eliminarlas una vez presentes.

Los procedimientos de despirogenación más comunes para los componentes físicos incluyen la incineración y la eliminación por lavado, también denominada dilución. La literatura ha demostrado que otros procedimientos, como la filtración, la irradiación y el tratamiento con óxido de etileno, tienen un efecto limitado en la reducción de los niveles de pirógenos/endotoxinas. Para los sistemas de agua para inyección, las dos formas aceptables de fabricación son la destilación y la ósmosis inversa.

La destilación ha demostrado ser eficaz y el método más fiable para eliminar las endotoxinas de las muestras de agua contaminada. Se han identificado problemas aislados relacionados con las salpicaduras en el alambique y la posterior contaminación del destilado. Del mismo modo, se ha sabido de problemas aislados con condensadores o intercambiadores de calor. Véase la ITG NO. 34, de fecha 31/7/79, para una discusión adicional sobre los intercambiadores de calor.

Como con la mayoría de los procesos y piezas de equipo, es una buena práctica conocer las limitaciones y/o capacidades del equipo. Por ejemplo, los alambiques con altos niveles de endotoxinas en el agua de alimentación han demostrado ocasionalmente que producen WFI de calidad inaceptable ( >.25 EU/ml). Además, cuando el WFI se produce por ósmosis inversa (OI), debe conocerse el nivel de endotoxinas del agua de alimentación. Como los filtros de ósmosis inversa no son absolutos, puede ser necesario tenerlos en serie para fabricar WFI libre de pirógenos. Cualquiera que sea el sistema empleado, la buena práctica incluiría la capacidad de aislar y evaluar cada pieza del equipo en un sistema WFI. Consulte la ITG nº 36, de 21/10/80, para una discusión sobre la ósmosis inversa.

Para los componentes físicos, como los tapones y los tubos, lo más habitual es el enjuague o la dilución con sistemas de agua libre de pirógenos. Algunos fabricantes, como los de LVP, están empleando la dilución para eliminar la endotoxina de los envases de vidrio que luego se esterilizan por otros medios. Al igual que la validación de la esterilidad, la validación de la reducción de endotoxinas debe incluir el conocimiento de la carga de endotoxinas y una prueba de endotoxinas satisfactoria. Cabe señalar que, debido a la falta de sensibilidad de la prueba de pirógenos de la USP realizada en conejos, las pruebas de «desafío» deben realizarse empleando la prueba de lisado de amebocitos de Limulus. Aunque no existe una guía en este ámbito, se esperaría que hubiera al menos una reducción de 3 log por debajo de la prueba de provocación de endotoxinas cuando se emplee el proceso de dilución.

Históricamente, los viales o los componentes de vidrio se han convertido en libres de pirógenos mediante la esterilización por calor seco a altas temperaturas. Algunos textos han recomendado la despirogenización de la cristalería y el equipo mediante el calentamiento a una temperatura de 250 C durante 45 minutos. Se ha informado de que 650 C durante 1 minuto o 180 C durante 4 horas, igualmente, destruirán los pirógenos. Los estudios de Tsuji et al, publicados en 1978, han demostrado que a temperaturas más bajas (de 170 C), la destrucción térmica sigue una tasa de segundo orden, y una reducción de 3 log de los niveles de endotoxinas a temperaturas más bajas podría no ser práctica.

Hay otros métodos menos comunes empleados para eliminar las endotoxinas. En la fabricación de polvos estériles, se suele emplear la cristalización o la purificación para eliminar las endotoxinas. Algunos fabricantes han recurrido ocasionalmente a métodos menos aceptables como el lavado o el enjuague del cristal o del polvo con un disolvente para eliminar las endotoxinas.

NOTA: Utilizar la dilución o el enjuague es aceptable para un componente físico como un tapón o un vial que no va a ser inyectado. Sin embargo, cuando se emplea para un componente químico, su valor es limitado. Sólo se puede garantizar que se reduzca el nivel de endotoxinas en la superficie exterior del polvo y no en todo el cristal.

Otros métodos generalmente menos aceptables son el tratamiento con óxido de etileno y la irradiación. Se ha demostrado que se han producido reducciones de aproximadamente el 80% en la pirogenicidad de la endotoxina de E. coli en los dializadores tras la exposición al óxido de etileno.

Con respecto a los equipos de fabricación y las líneas de transferencia, la despirogenación por dilución ha sido normalmente el método elegido. Ocasionalmente se ha empleado la utilización de un álcali fuerte o una solución oxidante para reducir los pirógenos en estos sistemas de almacenamiento/transferencia. Sin embargo, debe ser seguido por un enjuague con Agua para Inyección. Pueden conseguirse residuos en la solución de aclarado de menos de 1 parte por millón (ppm) y han sido aceptados.

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