Rasche Differenzierung von Methicillin-Resistenten Staphylococcus aureus und Methicillin-empfänglichen Staphylococcus aureus aus Blutkulturen mittels direktem Cefoxitin-Disk-Diffusionstest

Die Inzidenz von im Gesundheitswesen und in der Gemeinschaft erworbenen Staphylococcus aureus-Blutstrominfektionen hat in den letzten Jahrzehnten deutlich zugenommen (20). Im Bericht des National Nosocomial Infections Surveillance System von Januar 1992 bis Juni 2001 wurde festgestellt, dass mehr als 55 % der S. aureus-Isolate gegen Methicillin, Oxacillin oder Nafcillin resistent waren (16). Zu den Risikofaktoren, die mit einer Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA)-Bakteriämie assoziiert sind, gehören: Aufenthalt in einer Pflegeeinrichtung, frühere Antibiotikaexposition, insulinabhängiger Diabetes, längerer Krankenhausaufenthalt, Harnkatheterisierung, Platzierung einer nasogastralen Sonde, frühere Operationen und Vorliegen einer Grunderkrankung (13, 18, 19). Ältere Menschen (≥65 Jahre) haben ein signifikant höheres Risiko, an einer MRSA-Bakteriämie zu sterben, als jüngere Menschen (18, 22).

Die Infektion mit MRSA setzt den Patienten einem erhöhten Risiko für weitere gesundheitliche Probleme aus. Eine MRSA-Bakteriämie wurde mit einem erhöhten Risiko für akutes Nierenversagen, längeren Krankenhaus- und Intensivstationsaufenthalten, der Entwicklung einer Beatmungsgeräteabhängigkeit und erhöhten Krankenhauskosten in Verbindung gebracht (1, 6, 15). Mehrere Studien haben gezeigt, dass Patienten mit MRSA-Blutstrominfektionen ein signifikant höheres Sterberisiko haben als Patienten mit Methicillin-empfindlichen S. aureus (MSSA)-Blutstrominfektionen (1, 5, 19). Die Sterblichkeitsrate bei Patienten, die eine MRSA-Bakteriämie entwickeln, liegt schätzungsweise zwischen 23 % und 54 % (1, 8).

Patienten mit MRSA-Bakteriämie haben auch ein erhöhtes Risiko für eine verzögerte Behandlung (15). Eine unangemessene Antibiotikawahl bei Patienten mit S. aureus-Bakteriämie wurde ebenfalls mit einer höheren Krankenhaussterblichkeit in Verbindung gebracht (10). Ungeeignete Therapien bestanden aus β-Laktamen für MRSA-Bakteriämie und Vancomycin für MSSA-Bakteriämie. Die anfängliche Wahl von Vancomycin bei MSSA-Bakteriämie wurde mit einer höheren Inzidenz einer verzögerten Beseitigung der Infektion in Verbindung gebracht, und eine verzögerte angemessene Therapie bei MRSA-Patienten ist ein unabhängiger Prädiktor für die Mortalität (10, 15).

Die Wahl der Therapie bei Blutstrominfektionen ist mit der zunehmenden Antibiotikaresistenz, die bei vielen Organismen beobachtet wird, kritisch geworden. Die Zunahme von gram-positiven Organismen, die gegen Vancomycin resistent sind, bedroht viele akzeptierte Behandlungsschemata und rechtfertigt den empirischen Einsatz von Glykopeptiden bei Blutstrominfektionen (12). Daher ist die schnellere Charakterisierung von S. aureus-Isolaten aus Blutkulturen als oxacillinresistent oder oxacillinempfindlich ein wichtiger Faktor für die zeitnahe und präzise Behandlung bakteriämischer Patienten.

Blutkulturproben wurden in aeroben und anaeroben Flaschen (BacT/Alert FA und BacT/Alert FN Flaschen; bioMérieux, Durham, NC) gesammelt und im BacT/Alert 3D (bioMérieux, Durham, NC) untersucht. Proben von Blutkulturen, die auf Gram-Färbungen „gram-positive Kokken in Clustern“ zeigten, wurden auf einem Tupfer aus einem Aliquot aus der Blutflasche mit der gleichen Technik getränkt, die man bei der Vorbereitung eines Diskusdiffusions-Suszeptibilitätstests verwenden würde (3). Mit dem Tupfer wurde dann die gesamte Oberfläche einer 100-mm-Tryptic-Soja-Blutagarplatte (BD BBL, Franklin Lakes, NJ) abgestrichen, wie es auch bei einem Diskusdiffusionstest der Fall wäre. Anschließend wurde eine Cefoxitin-Scheibe (BBL Sensi-Disc, Franklin Lakes, NJ) in der Mitte der Platte platziert und die Platten wurden über Nacht (10 bis 24 h) bei 35 bis 37 °C in Raumluft inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Cefoxitin-Zonengrößen gemessen und aufgezeichnet. Die Ergebnisse der gemessenen Cefoxitin-Zonengröße wurden mit den Ergebnissen der Bestätigungstests verglichen. Zu den Bestätigungstests gehörte die Prüfung des isolierten Organismus auf Oxacillin-Empfindlichkeit sowohl mit der Vitek 2 GP-63 Empfindlichkeitskarte (bioMéreiux, Durham, NC) als auch mit dem standardisierten Cefoxitin-Diskusdiffusionstest (3, 4). Die Organismen wurden durch einen 4-Stunden-Röhrchen-Koagulase-Test, der direkt aus der Blutkulturbrühe durchgeführt wurde, als S. aureus identifiziert; die Identifizierungen wurden am selben Tag gemeldet, an dem die Blutkultur als positiv bestimmt wurde. Wenn die direkte Röhrchenkoagulase negativ war, wurden am nächsten Morgen, als die Cefoxitin-Zonengrößen abgelesen wurden, Objektträger- und/oder Röhrchenkoagulase-Tests an isolierten Kolonien durchgeführt.

Insgesamt wurden 782 Blutkulturproben getestet, von denen 276 eine Reinkultur von S. aureus anbauten (von 103 Patienten). Insgesamt 489 Proben wiesen Koagulase-negative Staphylokokken (CNS) auf, 12 wiesen Micrococcus species auf, 4 wiesen sowohl S. aureus als auch CNS auf und 1 wies Micrococcus species und CNS auf. Von den 276 Reinkulturen von S. aureus hatten 105 (38,1 %) direkte Cefoxitin-Zonengrößen, die ≤17 mm maßen, 18 (6,5 %) hatten solche, die 18 mm maßen, 8 (2,9 %) hatten solche, die 19 mm maßen, 8 (2,9 %) hatten solche, die 20 mm maßen, und 137 (49,6 %) hatten solche, die ≥21 mm maßen (Abb. 1). Alle Proben, die mit dem direkten Cefoxitin-Disk-Test Zonengrößen von ≤17 mm aufwiesen, wurden mit beiden Bestätigungsmethoden als oxacillinresistent bestätigt, und alle Proben mit Zonengrößen von ≥21 mm mit dem direkten Cefoxitin-Disk-Test wurden mit beiden Bestätigungsmethoden als oxacillinempfindlich bestätigt. Somit konnte der Nachweis von MRSA oder MSSA in Blutkulturen für 88 % der Kulturen mit absoluter Genauigkeit 10 bis 24 h früher gemeldet werden.

Vierunddreißig Proben mit Zonengrößen, die zwischen 18 und 20 mm maßen, enthielten eine Kombination von sowohl MRSA- als auch MSSA-Isolaten. Von diesen 34 Proben wurden 29 (85,3 %) als MRSA und 5 (14,7 %) als MSSA bestätigt. Dieser Zonengrößenbereich wurde dann als „unbestimmt“ bezeichnet, da die Oxacillin-Ergebnisse für Organismen, die in diesen Bereich fallen, nicht durch direkte Cefoxitin-Disk-Tests mit 100%iger Genauigkeit ermittelt werden konnten, sondern auf Bestätigungstests gewartet werden müssen. Man könnte sogar in Erwägung ziehen, alle Organismen mit Zonendurchmessern zwischen 18 und 20 mm als präsumtive MRSA zu bezeichnen, da über 85 % dieser Proben bei der Bestätigungstestung als MRSA bestimmt wurden. Diese Zonenbereiche (MRSA, ≤20 mm; MSSA, ≥21 mm) würden die Genauigkeit des direkten Cefoxitin-Disk-Tests >96% betragen.

Die Inkubationszeiten wurden für alle Studienisolate mit Zonendurchmessern von 18 bis 20 mm bewertet, um festzustellen, ob Proben mit kürzeren Inkubationszeiten wahrscheinlich zu unbestimmten Zonengrößen führen. Von den 34 Proben, die in den Bereich der unbestimmten Zonen fielen, hatten 3 (9 %) Inkubationszeiten von 10 bis 15 h, 9 (26 %) wurden zwischen 15 und 20 h inkubiert und 22 (65 %) wurden 20 bis 24 h inkubiert. Es gab keine Korrelation zwischen den Inkubationszeiten und den Durchmessern der unbestimmten Zonen; die Mehrheit der unbestimmten Proben hatte eine vollständige Inkubationszeit zwischen 20 und 24 Stunden, wobei <<15 Stunden Inkubation hatten.

Bei der Betrachtung der Proben pro Patient hatten 39 der 103 Patienten MRSA und 64 MSSA. Bei Verwendung der ersten positiven Blutkultur für jeden Patienten hatten 8 der 39 MRSA-Patienten unbestimmte Ergebnisse (Zonendurchmesser zwischen 18 und 20 mm), ebenso wie 2 der 64 Patienten mit MSSA. Bei der Bewertung der ersten positiven Blutkultur des Patienten mit dem direkten Cefoxitin-Disk-Test zur Bestimmung des Oxacillin-Ergebnisses wären also bei 93 der 103 (>90 %) Patienten die Organismen mit 100 % Genauigkeit genannt worden, wenn man die Parameter von ≤17 mm Zonendurchmesser für MRSA und ≥21 mm Zonendurchmesser für MSSA verwendet hätte, was den 88 % sehr nahe kommt, die bei der Prüfung jeder Blutkultur gesehen wurden. Obwohl wir keine Mischinfektionen von MRSA und MSSA (eine gefolgt von der anderen in nachfolgenden Blutkulturentnahmen) gesehen haben, empfehlen wir, alle „gram-positiven Kokken in Clustern“ aus Blutkulturen mit dem direkten Cefoxitin-Disk-Test zu testen, da dieses Szenario auftreten könnte.

Die Notwendigkeit, MRSA von MSSA aus Blutkulturproben zeitnah zu unterscheiden, ist von Bedeutung für die bestmögliche Versorgung der Patienten durch den schnellstmöglichen Einsatz von geeigneten Antibiotika. Zu den verschiedenen Verfahren zur Bestimmung von Staphylococcus-Spezies und/oder Oxacillin-Ergebnissen direkt aus Blutkulturflaschen gehören selektive Differenzierung auf chromogenem Agar (17), direkte Identifizierungsmethoden wie der BBL Crystal MRSA ID-Test (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD) (11) und molekulare Methoden, einschließlich des BD GeneOhm StaphSR Assays (Becton Dickinson, Sparks, MD), des Xpert MRSA/SA Blutkulturtests von Cepheid (Sunnyvale, CA), des Multiplex-Nachweises von mecA und der nuc-Gene (12), Nachweis der mecA- und orfX-Gene mittels Real-Time-PCR (21) sowie der IDI-Echtzeit-Assay (Infectio Diagnostic, Sainte-Foy, Quebec, Kanada) unter Verwendung des SmartCycler (Cepheid, Sunnyvale, CA) (7). Zusätzlich könnte der PBP2a-MRSA-Latex-Agglutinationstest (Oxoid Ltd., Basingstoke, Großbritannien) am Morgen nach der Subkultur positiver Proben verwendet werden, wenn ein ausreichendes Wachstum auftritt (abhängig von der Inkubationszeit). Dies würde eine ähnliche Durchlaufzeit wie unser Protokoll ergeben; der PBP2a-Latextest erfordert jedoch gut isolierte Kolonien, arbeitet am effizientesten, wenn er in Chargen durchgeführt wird, erfordert zusätzliche Personalzeit für den Test und ist kostspieliger.

Alle oben genannten Techniken verwenden zusätzliche Laborressourcen, wie z. B. Kit-ID-Systeme und/oder spezielle Medien oder molekulare Assays. Obwohl sie schnell und genau sind, werden diese Tests oft am besten für Batch-Tests verwendet, sind alle kostspieliger und arbeitsintensiver für das Labor und erfordern bei molekularen Tests oft zusätzliches molekulares Fachwissen und Geräte, die möglicherweise nicht ohne weiteres verfügbar sind. Diese Studie skizziert einen Ansatz zur Bestimmung des Oxacillin-Ergebnisses von S. aureus-Isolaten direkt aus Blutkulturproben, der kostengünstig und genau eingesetzt werden kann und nicht im Batch-Verfahren durchgeführt werden muss, sondern schnell und individuell an jeder Arbeitsstation abgelesen werden kann. Verständlicherweise würde das Labor alle Blutkulturen testen, die gram-positive Kokken in Clustern zeigen, aber da die Materialien und das Fachwissen, die für die Durchführung des direkten Cefoxitin-Disk-Tests benötigt werden, bereits Teil des diagnostischen mikrobiologischen Routinelabors sind, sind die zusätzlichen Kosten für eine tryptische Soja-Blutagarplatte und eine Cefoxitin-Disk die bescheidenen Ausgaben (∼$0,50/SA-Kultur) durchaus wert, um MSSA oder MRSA schneller aus Blutkulturen zu melden. Bei direkten Cefoxitin-Disk-Ergebnissen von ≤17-mm- oder ≥21-mm-Zonengrößen lag die Genauigkeit der Meldung der Oxacillin-Ergebnisse für S. aureus-Isolate bei 100 %. Durch die Verwendung dieses Protokolls kann das Labor ein genaues Oxacillin-Ergebnis bis zu 24 h schneller liefern als durch das Warten auf die Fertigstellung der Routine-Suszeptibilitäten. Es ist zu beachten, dass diese Breakpoints durch die Ergebnisse dieser Studie bestimmt wurden und nicht genau mit den vom CLSI veröffentlichten Werten für die Beurteilung der Oxacillin-Resistenz unter Verwendung von Cefoxitin-Disketten aus isolierten Staphylokokken-Kolonien übereinstimmen (4). Da diese Studie nicht auf CLSI-Richtlinien basierte, wurde Blutagar anstelle des klassischen Mueller-Hinton-Agars, der in standardisierten Testprotokollen verwendet wird, verwendet, da Blutagar kostengünstiger war (in unserer Einrichtung um ca. 40 %) und für Labore, die in erster Linie automatisierte Geräte für die Empfindlichkeitsprüfung verwenden, leichter verfügbar ist.

Durch die schnellere Meldung von Oxacillin-Ergebnissen für S. aureus-Isolate aus Fällen von Bakteriämie könnten Patienten früher mit dem wirksamsten Antibiotikum behandelt werden. Eine angemessene und schnelle Behandlung eines Patienten mit dem wirksamsten Antibiotikum verringert die Komplikationen für den Patienten, verkürzt die Dauer des Krankenhausaufenthalts für den Patienten und verringert die Morbidität und Mortalität des Patienten, was zu höheren Einsparungen für medizinische Einrichtungen führt (10, 14, 15, 18). Darüber hinaus wird der angemessenere Einsatz von Vancomycin die Entstehung von Resistenzen gegen dieses Medikament bei gram-positiven Organismen verringern (2, 9).

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