Obwohl das klassische Modell sehr nützlich für das Verständnis des Differenzierungsprozesses von HSCs war, ist es erwähnenswert, dass dieses Modell einige Mängel aufweist, da es die Komplexität von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) zu stark vereinfacht und nur auf den Oberflächenmarkern und der Transplantation mit Bulk-Zellen basiert. Die Bulk-Zellanalyse geht davon aus, dass jede Zelle, die den gleichen Phänotyp hat, eine identische Funktion besitzt. Mit Fortschritten in der Einzelzelltechnologie und genetischen Mausmodellen wurde dieses klassische Modell in den letzten Jahren in Frage gestellt, insbesondere bei der Aufklärung der Megakaryopoese. Darüber hinaus wurden neue Typen von HSPCs identifiziert und aufgrund ihrer Abstammungsneigung intensiv untersucht.
Heterogenität in der HSZ-Linienausgabe und Debatten über die Megakaryozyten-Differenzierung
Durch die Verwendung der Limiting-Dilution-Analyse und der Einzelzelltransplantation definierten die Gruppen von Sieburg und Eaves myeloid-biased (My-Bi), balanced (Ba) und lymphoid-biased (Ly-Bi) HSZs, basierend auf dem Verhältnis der Ausgabe von myeloiden zu lymphoiden Zellen (Muller-Sieburg et al, 2002; Muller-Sieburg et al., 2004; Dykstra et al., 2007; Benz et al., 2012) (Abb. 2A und 2B). Darüber hinaus wurde berichtet, dass plättchenbürtige HSZ eine My-Bi-Subgruppe sind, die an der Spitze der hämatopoetischen Hierarchie steht (Sanjuan-Pla et al., 2013) (Abb. 2C). Forscher haben das Konzept der LT-HSCs und ST-HSCs schon lange erkannt. Basierend auf dem Zeitraum der Rekonstitution wurden in mehreren Laboren intermediate-term HSCs (IT-HSCs) verwendet, die zwischen LT-HSC und ST-HSC liegen und bis zu 8 Monate nach der Transplantation zur Rekonstitution beitragen (Benveniste et al., 2010; Yamamoto et al., 2013). Darüber hinaus verfolgten Lu et al. einzelne HSZ in vivo mittels viraler genetischer Barcodierung in Kombination mit Hochdurchsatzsequenzierung (Lu et al., 2011). Auch sie zeigten Heterogenität in der HSC-Population. In diesem Assay zeigten sie, dass HSCs nicht gleichmäßig zur Nachkommenschaft beitragen und dass zwei unterschiedliche HSC-Differenzierungsmuster in derselben Empfänger-Maus nach der Bestrahlung koexistieren. Ein Differenzierungsmuster besteht aus Vorläuferzellpopulationen einschließlich GMPs, MEPs und CLPs; die andere Gruppe besteht aus reifen lymphoiden Blutzellen. In ähnlicher Weise beobachteten Yamamoto et al. bei der Einzelzelltransplantation, dass selbsterneuernde, linienbeschränkte Vorläuferzellen in phänotypisch definierten HSC existieren, die megakaryozyten-repopulierende Vorläuferzellen (MkRPs), megakaryozyten-erythrozyten-repopulierende Vorläuferzellen (MERPs) und gemeinsame myeloide repopulierende Vorläuferzellen (CMRPs) enthalten (Yamamoto et al., 2013) (Abb. 2D). Diese Studie legt nahe, dass oligo-, bi- und unipotente Zellen in HSC-Populationen koexistieren. Darüber hinaus können die SLAM-Familienmarker CD150 und CD229 HSCs in verschiedene Fraktionen mit Differenzierungsrekonstitutionsfähigkeit segregieren. Im Vergleich zu CD150med HSC zeigten CD150hi HSC ein höheres Selbsterneuerungspotenzial mit myeloischer voreingenommener Differenzierung (Morita et al., 2010). CD229- HSCs haben ein langfristiges Selbsterneuerungspotenzial mit myeloidem Bias und bilden alle anderen Stamm- und Vorläuferzellpopulationen, während CD229+ HSCs eine geringere Selbsterneuerungskapazität mit lymphoidem Bias zu haben scheinen (Oguro et al., 2013). Die einzelligen Omics-Analysen (Moignard et al., 2013; Wilson et al., 2015; Nestorowa et al., 2016; Buenrostro et al, 2018; Laurenti und Gottgens, 2018; Jacobsen und Nerlov, 2019), einschließlich der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) und des Einzelzell-Assays für Transposase-zugängliches Chromatin mittels Sequenzierung (scATAC-seq), haben das Vorhandensein von Heterogenität in den primitivsten HSC-Populationen weiter aufgedeckt.
(A) My-Bi und Ly-Bi HSCs Modell. Ly-Bi HSCs rekonstituieren die myeloide Linie in geringerem Ausmaß als die lymphoide Linie und umgekehrt. (B) Das Labor von Eaves definierte α-, β-, γ- und δ-Zellen nach dem Prozentsatz des myeloischen Chimärismus relativ zu dem des lymphoiden Chimärismus (M/L-Verhältnis). Eine einzelne Spenderzelle wird als α-Zelle definiert, wenn das M/L-Verhältnis 2 übersteigt, als β-Zelle, wenn das M/L-Verhältnis 0,25 übersteigt, aber kleiner als 2 ist, und als γ/δ-Zelle, wenn es kleiner als 0,25 ist. Daher sind α-Zellen myeloid-biased, β-Zellen balanced und γ/δ-Zellen lymphoid-biased ohne 2. Transplantationsfähigkeit. (C) vWF+-Plättchen-biased HSCs sitzen an der Spitze der Hierarchie und können sich in alle Progenitoren und reifen Zellen differenzieren. vWF- lymphoid-biased HSCs befinden sich stromabwärts von vWF+ HSCs. LMPPs können nicht die Megakaryozyten-/Erythrozyten-Linie hervorbringen. MEPs werden direkt von HSCs abgeleitet. (D) Im myeloischen Bypass-Modell enthält die LT-HSC-Population CMRPs, MERPs und MkRPs. Diese MyRPs werden direkt von HSCs produziert. (E) MPP-Subtypen werden in MPP1-4 unterteilt. MPP1 kann alle Lineages hervorbringen. MPP2/3 sind myeloid und MPP4 ist lymphoid. Zusätzlich ist MPP2 plättchenbasiert. (F) In diesem Modell differenzieren sich die MPPs in Pre MegE, Pre GM und CLP. Pre MegE ist stromaufwärts von MkP und pre CFU-E. Aus Pre GM entsteht GMP und anschließend neu definierte neutrophile Vorstufen (Pre Neu)
Der Ursprung der Megakaryozyten wird seit einigen Jahren diskutiert. Die Jacobsen-Gruppe identifizierte lymphoid-primed MPPs (LMPPs), aus denen Granulozyten/Makrophagen und lymphoide Linien entstehen, aber keine Megakaryozyten/Erythrozyten-Linie (Adolfsson et al., 2005) (Abb. 2C). Studien zum Lineage Tracing stellen diese Ansicht jedoch in Frage und legen nahe, dass sich LMPPs auch in eine Megakaryozyten/Erythrozyten-Linie differenzieren (Forsberg et al., 2006; Boyer et al., 2011). Die unterschiedlichen Ergebnisse können auf die für die Transplantation verwendete Zelldosis und die in den verschiedenen Labors verwendeten Methoden, einschließlich Mausmodellen, zurückgeführt werden. In jüngerer Zeit wurde die mRNA-Expression des Megakaryozyten-Markers von Willebrand-Faktor (vWF) und des Oberflächenrezeptors c-Kit als Hinweis auf eine plättchengebundene, aber multipotente HSZ-Subpopulation vorgeschlagen (Sanjuan-Pla et al., 2013; Shin et al., 2014). Beweise für eine plättchenbasierte Population von HSCs wurden von der Jacobsen-Gruppe erbracht (Sanjuan-Pla et al., 2013). Sie fanden heraus, dass 25 % der LT-HSCs vWF exprimieren und vWF+ HSCs für die plättchenspezifische Genexpression grundiert sind, mit einer erhöhten Neigung zur langfristigen Rekonstitution von Thrombozyten. Die vWF+ plättchenprimierten HSCs haben auch eine langfristige myeloische Linienausrichtung, können sich selbst erneuern und können vWF-lymphoide HSCs hervorbringen (Abb. 2C). Daher stehen die plättchenprimierten HSCs an der Spitze der hämatopoetischen Hierarchie. Darüber hinaus wurde auf der Grundlage von Einzelzelltransplantationsexperimenten die Existenz von Megakaryozyten-Linien beschränkten Zellen im phänotypischen HSZ-Kompartiment vorgeschlagen (Yamamoto et al., 2013). Der Paar-Tochterzelltransplantationstest zeigt, dass Megakaryozytenvorläufer direkt von HSCs abstammen (Yamamoto et al., 2013) (Abb. 2D). Später wurde in einer Studie berichtet, dass das HSC-Kompartiment stammähnliche Megakaryozyten-verpflichtete Vorläufer (SL-MkPs) enthält, eine Zellpopulation, die viele Merkmale mit HSCs teilt (Haas et al., 2015). Diese Population wird bei entzündlichem Stress aktiviert, um Thrombozyten effizient zu erneuern, so dass eine mögliche Abkürzung von HSCs zu Megakaryozyten unter entzündlichen Bedingungen vorgeschlagen wurde (Haas et al., 2015). Darüber hinaus zeigte ein aktueller Bericht aus dem Labor von Jacobsen durch die Verfolgung von Vorläuferzellen und reifen Linienzellen, die aus einzelnen transplantierten HSCs gebildet werden, dass eine bestimmte Klasse von HSCs ein Schicksal zur langfristigen und effektiven Auffüllung von Megakaryozyten/Thrombozyten ohne Auffüllung anderer Blutzelllinien annimmt, während keine HSCs ausschließlich zu irgendeiner anderen einzelnen Blutzelllinie beitragen (Carrelha et al, 2018).
Kollektiv teilen HSCs und Megakaryozyten mehrere Merkmale, z. B. die Expression von Thrombopoietin-Rezeptor (MPL), CD150, CXCR4 und vWF, etc. (Wang et al., 1998; Sugiyama et al., 2006; Pronk et al., 2007; Yoshihara et al., 2007; Huang und Cantor, 2009). Noch wichtiger ist, dass Megakaryozyten auch als eine HSC-Nischenkomponente dienen und die Aufrechterhaltung der HSC-Funktion eng regulieren (Bruns et al., 2014; Zhao et al., 2014). Thrombozyten- und myeloide vWF+ HSCs, aber nicht lymphoide vWF- HSCs, assoziieren mit Megakaryozyten und werden durch Megakaryozyten reguliert (Pinho et al., 2018). Alle Hinweise deuten darauf hin, dass HSCs und der Megakaryozyt (bzw. dessen Vorläufer) in der hämatopoetischen Entwicklungshierarchie näher beieinander liegen als bisher angenommen. In Anbetracht der Heterogenität, die in der HSZ-Population beobachtet wurde, sind wir der Ansicht, dass in den HSZ eine Vorbestimmung der Abstammung (des Zellschicksals) stattfindet, bevor sie sich zu Vorläuferzellen differenzieren. Darüber hinaus kann der Megakaryozyt unabhängig von anderen Linien entstehen, und der Differenzierungsweg der Megakaryozyten ist in der Hierarchie zunächst von anderen Blutzelllinien getrennt.
Heterogenität in MPPs
Die Trumpp (Wilson et al, 2008) und Passegue (Pietras et al., 2015) unterteilten die MPP-Population weiter in MPP1, MPP2, MPP3 und MPP4 nach ihrem Immunphänotyp, Zellzyklusstatus, Lineage Bias, Resistenz gegen medikamentöse Behandlung und Knochenmarkshäufigkeit. MPP1 ähnelt mehr den zuvor definierten IT-HSC oder ST-HSC, die bei der ersten Transplantation eine Mehrlinien-Rekonstitutionsfähigkeit von bis zu 4 Monaten haben, während MPP2/3/4 kein Selbsterneuerungspotential besitzen und nur eine kurzfristige myeloische Rekonstitutionsfähigkeit aufweisen (<1 Monat). Noch wichtiger ist, dass MPP2 und MPP3 geringe Mengen an T- und B-Zellen produzieren und MPP4 geringe Mengen an myeloischen Zellen in vivo erzeugt. Darüber hinaus produziert MPP2 im Vergleich zu MPP3 und MPP4 höhere Mengen an Thrombozyten. Zusammengefasst ist MPP2 eine Megakaryozyten-lastige MPP-Untergruppe und MPP3 eine Myeloiden-lastige MPP-Untergruppe. Sowohl MPP2 als auch MPP3 unterscheiden sich funktionell von der lymphoid-primierten MPP4. HSCs generieren unabhängig voneinander alle drei Typen von lineage-biased MPPs (MPP2-4), aber unter ihnen sind keine MPPs in der Lage, andere MPPs in vivo zu generieren (Abb. 2E). Nach der Transplantation produzieren HSCs zunächst myeloide MPPs (MPP1/2), um schnell eine myeloide Produktion aufzubauen, gefolgt von der lymphoid-primierten MPP4-Subpopulation, um das lymphoide Kompartiment wieder aufzubauen. Daher sind MPPs eine heterogene Population mit unterschiedlichem lineage-biased Potential sowohl auf zellulärer als auch auf molekularer Ebene.
Heterogenität und Hierarchie innerhalb der myeloischen Progenitoren
Im klassischen Modell werden CMPs und MEPs nach der CD34-Expression getrennt. In der Lin-cKit+Sca1- (LKS-) Population sind CMPs CD34+CD16/32-, während MEPs CD34-CD16/32- sind. Es wird angenommen, dass CMPs eine Oligopotenz besitzen, die ein Granulozyten-, Makrophagen-, Megakaryozyten- und Erythrozyten-Differenzierungspotenzial beinhaltet. CMPs haben jedoch eine geringe klonale Häufigkeit von gemischten myeloischen Kolonien, und MEPs besitzen ebenfalls ein geringes Megakaryozyten-Potenzial (Nakorn et al., 2003). Daher drängt sich die Frage auf, ob jede CMP oder MEP ein unterschiedliches Lineage-Potential auf Einzelzellebene hat, d.h., ob jede CMP tatsächlich oligo-potent ist und ob MEP bipotent ist.
Um die Heterogenität und das Lineage Commitment in der LKS- myeloischen Progenitorpopulation zu verstehen, insbesondere in CMPs, verwendeten Pronk et al. (Pronk et al., 2007) CD150, CD105 (Endoglin), CD41 und CD16/32, um die LKS- myeloischen Progenitoren zu re-segregieren. In der LKS- Population werden CD41+CD150+ Zellen als Megakaryozytenprogenitoren (MkPs) definiert, die ausschließlich mit der Megakaryozytenbildung assoziiert sind. CD41-CD150- CD16/32+ Zellen sind GMPs. In der CD41-CD150-CD16/32- Population (klassische MkPs und MEPs-Mischung) gibt es vier neu definierte Sub-Populationen, darunter Pre MegEs, Pre GMs, Pre CFU-Es und CFU-Es (Pronk et al., 2007). Einzelne Pre-MegE-Zellen können effektiv megakaryozytäre, erythroide sowie gemischte megakaryozytäre/erythroide Kolonien produzieren. Im Gegensatz dazu entstehen aus Pre-CFU-E-Zellen fast ausschließlich erythroide Kolonien unterschiedlicher Größe. Prä-GMs liegen entwicklungsmäßig vor den GMPs und haben einen bemerkenswert ähnlichen klonalen Lineage-Output wie die GMPs. Daher erforscht die Studie von Pronk et al. die Prozesse der myeloischen Zelldifferenzierung, enthüllt eine Reihe neuartiger intermediärer Vorläuferzellen und entwirft ein neues Hierarchiemodell, das unipotente proliferative neutrophile Vorläufer einschließt (Kim et al., 2017; Evrard et al., 2018; Zhu et al., 2018). Klassische MkPs bestehen aus Prä-MkPs, und die Mehrheit der Prä-MkPs und MkPs werden in CFU-E, Prä-CFU-Es und einen Teil der Prä-MkPs unterteilt. Außerdem sind MkPs hauptsächlich in CMPs lokalisiert (Pronk et al., 2007) (Abb. 2F).
In Übereinstimmung mit den oben diskutierten Arbeiten berichtet eine wegweisende Arbeit aus Amits Labor über die Transkriptome von mehr als 2.600 einzelnen LKS-myelo-erythroiden Vorläuferzellen der Maus (Paul et al, 2015) und eine nachfolgende Arbeit aus Gottgens‘ Labor, in der die Transkriptome von 1.600 HSPCs berichtet wurden (Nestorowa et al., 2016), zeigten beide Heterogenität in LKS-Vorläuferzellen. Die Einzelzellen aus klassischen MEPs zeigen keine Expression von Megakaryozytenmarkern oder prominenten Megakaryozyten-TFs. Jedoch werden sowohl Megakaryozytenmarker (Pf4 und CD41) als auch TFs (Pbx1, Fli1, Mef2c) in den Zellen aus klassischen CMPs exprimiert (Paul et al., 2015).
Zusammengenommen erklären alle Studien, warum sich Megakaryozyten hauptsächlich aus CMPs, aber nicht aus MEPs differenzieren und MEPs hauptsächlich Erythrozyten hervorbringen. Dies deutet darauf hin, dass die klassischen MEPs nicht der wahre Vorläufer der Megakaryozyten sind.
Hämatopoetische Differenzierung ist ein kontinuierlicher Prozess
Vorangegangene Studien zeigten, dass einzelne HSCs allmählich Linienvorlieben entlang mehrerer Richtungen erwerben, während sie diskrete hierarchisch organisierte Vorläuferpopulationen durchlaufen (Abb. 3A). Diese Modelle beruhen jedoch auf der Analyse von vordefinierten, durchfluss-sortierten Zellpopulationen. Mit Fortschritten in der Methodik ist es möglich geworden, die Ähnlichkeiten oder Unterschiede einzelner HSPCs und ihre Differenzierungsbeziehungen zu untersuchen.
(A) Das diskrete Differenzierungsmodell zeigt, dass die Differenzierung von HSZs zu reifen Stammzellen ein schrittweiser Prozess ist, der einer baumartigen Hierarchie von oligo-, bi- und unipotenten Vorläufern folgt. (B) Das kontinuierliche Differenzierungsmodell zeigt, dass es keine offensichtliche Grenze in der Hierarchie gibt. Einzelne HSCs erwerben allmählich Linienvorlieben entlang mehrerer Richtungen, ohne diskrete, hierarchisch organisierte Vorläuferpopulationen zu durchlaufen
Durch die Verwendung von scRNA-seq in Kombination mit rechnerischer Analyse, Eine kürzlich durchgeführte Studie an umfassend beprobten HSPCs aus menschlichem Knochenmark legt ein Modell nahe, in dem der Erwerb von linienspezifischen Schicksalen ein kontinuierlicher Prozess ist und auf eine Linie beschränkte Zellen direkt aus einem Kontinuum von niedrigprimierten undifferenzierten HSPCs hervorgehen, ohne einen größeren Übergang durch die multi- und bi-potenten Stadien (Velten et al., 2017). Diese Ansicht wird durch eine Zebrafisch-Studie unterstützt, die nahelegt, dass das Kontinuum der HSPC-Differenzierung durch ein hochkoordiniertes Transkriptionsprogramm gekennzeichnet ist, das eine gleichzeitige Unterdrückung von zellproliferationsbezogenen Genen und eine Hochregulierung von linienspezifischen Genen aufweist (Macaulay et al., 2016). Eine weitere Studie mit lympho-myeloiden Vorläuferzellen aus menschlichem Nabelschnurblut, einschließlich LMPPs, GMPs und multi-lymphoiden Vorläuferzellen (MLPs), legt zudem ein Modell nahe, in dem ein Kontinuum von Vorläuferzellen die lymphoide und myeloide Differenzierung ausführt, anstatt dass nur einseitige Vorläuferzellen stromabwärts von Stammzellen vorhanden sind (Karamitros et al., 2018). Obwohl die meisten Progenitoren ein Unilineage-Potenzial haben, sind Bi- und Oligolineage-Progenitoren unter den LMPPs, GMPs und MLPs vorhanden. Diese oben erwähnten Studien ändern unsere Ansicht, dass die hämatopoetische Differenzierung ein kontinuierlicher Prozess ist und nicht eine diskrete Hierarchie, was darauf hindeutet, dass es keine offensichtliche Grenze zwischen Stammzellen und Vorläuferzellen gibt (Laurenti und Gottgens, 2018) (Abb. 3B).
Die Roadmap der menschlichen Hämatopoese
In der menschlichen Hämatopoese sortierte die Dick-Gruppe MPPs, CMPs und MEPs aus der fetalen Leber und dem adulten Knochenmark und verglich ihr Abstammungspotenzial in verschiedenen Entwicklungsstadien (Notta et al, 2016). Sie zeigten, dass zuvor definierte MPPs, CMPs und MEPs heterogen sind. Wichtig ist, dass MEPs, sowohl aus der fetalen Leber als auch aus dem Knochenmark, einheitlich nur erythroide Klone produzieren. Daher sind die klassisch definierten MEPs hauptsächlich erythroide Vorläufer, wenn sie bei Einzelzellauflösung analysiert werden, und nicht Megakaryozyten/erythroide Vorläufer, wie bisher angenommen, was mit der Beobachtung in einem Mausmodell übereinstimmt (Pronk et al., 2007). Interessanterweise enthält die fetale Leber eine große Anzahl von unterschiedlichen oligopotenten Vorläuferzellen. Im adulten Knochenmark waren jedoch nur wenige oligopotente Progenitoren vorhanden. Stattdessen überwiegen nur zwei Progenitorklassen, multipotent und unipotent, wobei die Megakaryozyten/Erythroiden-Linien aus multipotenten Zellen hervorgehen. Die Studie der Dick-Gruppe liefert ein überarbeitetes Modell zum Verständnis der normalen Hämatopoese, die in der Tat entwicklungszeitlich flexibel ist.