54.9.5 Structure-Activity Aspects of the Cbl Transporters
Intrinsic Factor bindet B12 mit einer Dissoziationskonstante von mehr als 1012 mol/L.361 Im Vergleich zu Haptocorrin ist Intrinsic Factor in zweierlei Hinsicht einzigartig. Er bindet B12, aber nicht das breite Spektrum der Corrinoide, die von Haptocorrin erkannt werden, und im Gegensatz zu Haptocorrin wird er nicht von den Enzymen im oberen GI-Trakt verdaut. Diese Eigenschaften stellen sicher, dass nur B12-Formen, die von Intrinsic Factor erkannt werden, zur Absorption im terminalen Ileum präsentiert werden. Intrinsic Factor ist ein Protein mit einer Aminosäurekette, die ~ 50 kDa (417 Aminosäuren) groß ist. Das Protein kann in zwei Teile zerfallen: ein 30 kDa N-terminales Fragment und ein 20 kDa C-terminales Fragment. Interessanterweise erkennt jeder dieser beiden Teile B12, aber wenn sie zusammen in Lösung sind, binden sie nur ein Molekül B12.338 Diese Befunde stehen im Einklang mit der dreidimensionalen Struktur des intrinsischen Faktors, die zeigt, dass B12 zwischen der N-terminalen α-Untereinheit und der C-terminalen β-Untereinheit327,335 eingebettet ist (Abb. 54.15). Die dreidimensionale Struktur bietet auch eine Erklärung für den Befund, dass ein 20-50 Aminosäuren C-terminal verkürzter Intrinsic Factor keine hochaffine Bindung von B12 mehr zeigt.362 Der C-terminale Teil des Moleküls enthält alle Wasserstoffbrücken und die meisten hydrophoben Bindungen, die an der Erkennung von B12 durch die β-Untereinheit des Moleküls beteiligt sind.
Es ist seit langem bekannt, dass Intrinsic Factor B12-Formen mit unterschiedlichen Oberliganden in vergleichbarer Weise erkennt (z. B., Met-B12 im Vergleich zu CN-B12) und in Übereinstimmung mit diesem Wissen zeigt die vorhergesagte Kristallstruktur, dass der obere Ligand dem Lösungsmittel ausgesetzt ist.305,327 Die Spezifität für B12, die der intrinsische Faktor im Vergleich zu Haptocorrin antrifft, kann durch das Vorhandensein von sperrigen Aminosäuren wie Tryptophan und Tyrosin in der B12-Bindungstasche von Haptocorrin, aber nicht des intrinsischen Faktors erklärt werden.327
Etwa 10 Patienten mit Mutationen im GIF-Gen, das für den intrinsischen Faktor kodiert, wurden beschrieben, aber solche Mutationen haben nicht zu unserem Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehungen für die Bindung von B12 an den intrinsischen Faktor beigetragen, da die meisten von ihnen durch zwei spezifische Nonsense-Mutationen erklärt werden.323,363 Derzeit ist nicht klar, ob ein Austausch der Aminosäure Nummer fünf von einer Glutaminsäure zu Arginin mit einer beeinträchtigten Funktion des Intrinsic-Faktors zusammenhängt.327,364
Intrinsic-Faktor ist ein Glykoprotein, und man nimmt an, dass die Kohlenhydratstruktur für seine Stabilität gegenüber enzymatischem Abbau wichtig ist, obwohl dies unzureichend untersucht ist, zum Teil weil die Kohlenhydratstruktur des menschlichen Intrinsic-Faktors noch nicht aufgeklärt ist. Anhand von Ratten-Intrinsic-Faktor konnte gezeigt werden, dass der Kohlenhydratanteil weder für die Erkennung von B12 noch für die Bindung des Intrinsic-Faktors an seinen Rezeptor von Bedeutung ist.365
Die Struktur des Cubam-Rezeptors ist ziemlich einzigartig. Cubilin erkennt den intrinsischen Faktor, während Amnionless über zwei Aminosäuresequenzsignale aus Phenylalanin-Asparagin-Prolin (FXNPXF) innerhalb der zytosolischen Domäne für die Membranverankerung und die endozytische Kapazität sorgt. Die beiden Signale fördern die Internalisierung des gesamten Komplexes über die Bindung an die Clathrin-assoziierten Sortierproteine disabled-2 (Dab2) und autosomal-rezessive Hypercholesterinämie (ARH).366 Der Amnionless-Teil von Cubam wurde aufgrund einer Kopplungsgleichgewichtsanalyse von Patienten mit Imerslund-Gräsbeck-Syndrom identifiziert, die keine Mutationen im Cubilin-Gen aufwiesen, und später wurden mehrere Mutationen in Amnionless mit dieser Krankheit in Verbindung gebracht, wobei es Cluster in Norwegen und im Mittelmeerraum gab.325,344 Aufwendige Studien in Mäusen und in einem Hundemodell mit spontanen Mutationen im amnionless-Gen haben gezeigt, dass das Protein nicht nur für die Internalisierung von Cubilin-gebundenen Liganden essentiell ist, sondern auch für das Eskortieren von Cubilin an die Zelloberfläche.316,367 Das Ergebnis impliziert, dass kein Cubam auf der Zelloberfläche exprimiert wird, wenn Amnionless beeinträchtigt ist und als Konsequenz die Aufnahme von B12 beeinträchtigt ist.368
Der Teil von Cubam, der den intrinsischen Faktor B12 erkennt, ist Cubilin. Der Komplex wurde kristallisiert (Abb. 54.15).342 Die β- und α-Untereinheiten des Intrinsic-Faktors sind an der Calcium-abhängigen Bindung beteiligt, die auch die Anwesenheit von B12 erfordert, wie zuvor durch Studien zur Bindung der beiden Intrinsic-Faktor-Untereinheiten an Cubilin vorhergesagt wurde.339 Der N-terminale Teil von Cubilin, einschließlich der CUB-Domänen 5-8, ist für die Erkennung des Intrinsic Factors verantwortlich und die Kristallstruktur zeigt, dass es sich bei den Bindungsdomänen um CUB 6 und CUB 8 handelt.342,369 Die Bedeutung von CUB 5-8 basiert auf der Beobachtung, dass eine Cubilin-Mutation, die Prolin mit Leucin in Position 1297 austauscht, die Bindung zwischen Cubilin und Intrinsic Factor beeinträchtigt.370 Diese spezielle Mutation wurde bei finnischen Patienten mit Imerslund-Gräsbeck-Syndrom beobachtet, obwohl auch eine Reihe anderer Mutationen in Cubilin mit der Krankheit in Verbindung gebracht wurden.325
Obwohl die Struktur-Funktions-Beziehung für die Bindung von Intrinsic Factor an Cubilin gut dokumentiert ist, ist weit weniger über die Spezifität der Bindung anderer Proteine an Cubilin bekannt. In der Niere ist der Cubam-Rezeptor an der proximalen Reabsorption einer Vielzahl von Proteinen beteiligt, darunter das Vitamin-D-bindende Protein (Gc), Transferrin und Albumin (Übersicht siehe Ref. 326). Folglich zeigen viele Patienten mit Imerslund-Gräsbeck-Syndrom eine erhöhte Ausscheidung einiger dieser Proteine im Urin. Studien, die den Zusammenhang zwischen spezifischen Veränderungen von Cubilin und den im Urin vorkommenden Proteinen klären, könnten weitere Struktur-Funktions-Beziehungen aufdecken.