In dieser Zeichnung des französischen Künstlers Jacques le Moyne de Morgues fliehen Timucua vor den spanischen Siedlern, die per Schiff ankamen. Le Moyne lebte in Fort Caroline, dem französischen Außenposten, bevor die Spanier die Kolonie 1562 zerstörten.
Spanien fasste im heutigen Florida Fuß und betrachtete dieses Gebiet und die Länder im Norden als eine logische Erweiterung seines karibischen Reiches. 1513 hatte Juan Ponce de León das Gebiet um das heutige St. Augustine für die spanische Krone beansprucht und das Land nach dem nächstgelegenen Festtag Pascua Florida (Fest der Blumen oder Ostern) benannt. Ponce de León war nicht in der Lage, dort eine dauerhafte Siedlung zu errichten, aber 1565 brauchte Spanien einen Außenposten, um den französischen und englischen Freibeuter zu begegnen, die Florida als Basis nutzten, um mit Schätzen beladene spanische Schiffe auf dem Weg von Kuba nach Spanien anzugreifen. Die Bedrohung der spanischen Interessen nahm 1562 eine neue Wendung, als eine Gruppe französischer Protestanten (Hugenotten) eine kleine Siedlung, die sie Fort Caroline nannten, nördlich von St. Augustine gründeten. Mit der Genehmigung von König Philipp II. führte der spanische Adlige Pedro Menéndez einen Angriff auf Fort Caroline an, tötete die meisten Kolonisten und zerstörte das Fort. Die Beseitigung von Fort Caroline diente den Spaniern zu einem doppelten Zweck: Sie verringerte die Gefahr durch französische Freibeuter und beseitigte die französische Bedrohung für Spaniens Anspruch auf das Gebiet. Der Streit um Florida illustriert, wie europäische Rivalitäten auf den amerikanischen Kontinent übergriffen, insbesondere religiöse Konflikte zwischen Katholiken und Protestanten.
Im Jahr 1565 gründete der siegreiche Menéndez St. Augustine, heute die älteste europäische Siedlung auf dem amerikanischen Kontinent. Dabei vertrieben die Spanier die einheimischen Timucua-Indianer aus ihrer alten Stadt Seloy, die seit Jahrtausenden bestand. Die Timucua litten stark unter den von den Spaniern eingeschleppten Krankheiten und schrumpften von einer Bevölkerung von etwa 200.000 vor dem Kontakt auf fünfzigtausend im Jahr 1590. Um 1700 waren nur noch eintausend Timucua übrig. Wie in anderen Gebieten der spanischen Eroberung arbeiteten katholische Priester daran, eine spirituelle Eroberung herbeizuführen, indem sie die überlebenden Timucua, die demoralisiert waren und unter den katastrophalen Verlusten von Familie und Gemeinschaft litten, zwangen, zum Katholizismus zu konvertieren.
Das spanische Florida war ein einladendes Ziel für Spaniens imperiale Rivalen, besonders für die Engländer, die sich Zugang zur Karibik verschaffen wollten. Im Jahr 1586 entdeckten die spanischen Siedler in St. Augustine ihre Verwundbarkeit gegenüber Angriffen, als der englische Pirat Sir Francis Drake die Stadt mit einer Flotte von zwanzig Schiffen und hundert Mann zerstörte. In den nächsten Jahrzehnten bauten die Spanier weitere hölzerne Forts, die jedoch alle von überfallartigen europäischen Rivalen niedergebrannt wurden. Zwischen 1672 und 1695 errichteten die Spanier ein steinernes Fort, Castillo de San Marcos, um St. Augustine besser gegen Angreifer verteidigen zu können.
Das spanische Fort Castillo de San Marcos half den spanischen Kolonisten in St. Augustine, marodierende Freibeuter aus rivalisierenden europäischen Ländern abzuwehren.